一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及检测方法

摘要

本发明涉及一种香菇病毒检测方法，具体涉及一种香菇dsRNA病毒的RT-PCR引物及检测方法，属于生物技术领域。所述RT-PCR引物见SEQ NO.1-2，检测方法首先提取香菇dsRNA，通过反转录成cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，建立香菇dsRNA病毒的RT-PCR检测，RT-PCR产物大小为852bp。本发明检测时间较短、灵敏度高（检测体系只需要10ng的dsRNA就可清晰检测出，用病毒特有引物进行反转录，增强了特异性和提高检测结果的可靠性）、检测结果可靠、容易判断、重复性好等优点。基因是遗传的物质基础，不易受外界因素等的影响，同时得到的检测图谱具有特异性条带：852bp，其显性标记判断一目了然。

主权项

一种香菇dsRNA 病毒的RT‑PCR 检测方法，其特征在于：所述RT‑PCR 检测方法具体包括以下步骤：（1）香菇dsRNA 的提取；（2）将提取的香菇dsRNA 通过反转录成cDNA ：在PCR 管中加入100 ng/μl dsRNA 1μl、10 μmol/L 反向引物L1‑A 1.5 μl、DEPC 水7.5μl，95℃保温5 min，然后迅速放置冰上5 min，再添加5×RTBuffer 4 μl、10 mmol/L dNTPs 1 μl、40 U/μl RNA 酶抑制剂 0.5 μl、100 U/μl 反转录酶M‑MLV 0.5 μl、DEPC 水5μl，放置PCR 仪上，42℃反应1 h，70℃灭活10 min，即得到反转录的cDNA；其中反向引物L1‑A 为5’‑AGACAAGATGGAGACG‑3’；（3）RT‑PCR 检测：以反转录的cDNA 为模板，建立香菇dsRNA 病毒的RT‑PCR 检测，PCR扩增体系：cDNA模板2 μl、含15 mmol/L MgCl₂的10×PCR Buffer 3μl、2.5 mmol/L dNTPs 1.5μl、10 μmol/L 序列为5’‑ACCGCAATCAATAACT‑3’的引物L1‑S 0.48 μl、10μmol/L 序列为5’‑AGACAAGATGGAGACG ‑3’的引物L1‑A 0.48 μl、5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.24 μl，用DEPC 水补足至30 μl；PCR 反应条件：95℃ 5min ；95℃ 45sec，48.5℃ 45sec，72℃ 1min，30 个循环；72℃ 10min ；（4）RT‑PCR 产物的检测结果：根据电泳检测的DNA 图谱，若扩增出分子量为852bp 的特异DNA 条带标记为香菇菌株带有dsRNA 病毒，若未扩增出特异DNA 条带则表示不携带dsRNA病毒。