一种联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法

摘要

本发明涉及一种联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法，包括以下步骤：(1)食物样品消化和测定液的获取：a.食物样品收集后，磨碎，采用胃液和肠液依次消化；b.将消化混合液离心，收取上清液，高压灭菌；(2)单独培养Caco-2细胞和293T细胞；(3)Caco-2细胞和293T细胞的联合培养：将培养有Caco-2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的六孔板中，继续培养24h；(4)镉生物有效性和毒性评价：将食物样品测定液置于联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时在293T细胞层上加入等渗的孵育液，继续培养24h；慢性毒性试验时，可最长联合培养10d；(5)指标检测。本发明具有操作简单、试验条件易控制、污染小、经济、结果准确等特点，并具有生物有效性和毒性联合评价的优点。适合谷物、蔬菜和动物性食物镉蓄积的安全性评价。

主权项

一种联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)食物样品消化和测定液的获取：a.食物样品收集后，磨碎，采用胃液和肠液依次消化；b.将消化混合液离心，收取上清液，高压灭菌；(2)单独培养Caco‑2细胞和293T细胞：a.Caco‑2细胞(人结肠癌细胞系)培养于六孔板插入槽的聚碳酸酯膜上；b.293T细胞(人胚肾T细胞系)培养于另一块六孔板的底部；(3)Caco‑2细胞和293T细胞的联合培养：将培养有Caco‑2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的六孔板中，继续培养24h；(4)镉生物有效性和毒性评价：将食物样品测定液置于联合培养模型的Caco‑2细胞层上，同时在293T细胞层上加入等渗的孵育液，继续培养24h；慢性毒性试验时，可最长联合培养10d；(5)指标检测：a.用电感耦合等离子体质谱(ICP‑MS)技术测定细胞吸收的镉量；b.通过观察细胞的形态学、MTT比色、LDH活性、细胞凋亡以测定镉对细胞的毒性；步骤(2)Caco‑2细胞和293T细胞单独培养方法具体为：具体为Caco‑2细胞和293T细胞单独培养于25cm²培养瓶中，并定期换液、传代和细胞形态结构观察，保证细胞培养过程中不受污染，形态结构正常；达到试验需要的数量后，将Caco‑2细胞转入六孔培养板的插入槽上培养；293T细胞转入另一个六孔培养板的底部培养；步骤(3)Caco‑2细胞和293T细胞联合培养方法具体为：通过测定Caco‑2细胞层甘露醇透过率和细胞跨膜电阻值，以评价Caco‑2细胞层的完整性，甘露醇透过率低于0.5％·h^‑1·cm^‑2，细胞跨膜电阻值稳定高于250Ω·cm²；通过相差显微镜下观察293T细胞层形态良好，结构完整、紧密；将培养有Caco‑2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的培养板中，并在插入槽上部和培养板底部加入培养液，37℃二氧化碳培养箱中联合培养24h。