一种香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂及其制备方法

摘要

本发明提供一种香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂及其制备方法，包括以下几个步骤：步骤A:制备植物乳杆菌冻干菌剂；步骤B:制备冻干产朊假丝酵母；步骤C:制备冻干单宁酶；步骤D：依次复活植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母和单宁酶；步骤E：将所得到的复活菌剂充分搅拌后制成复活水，保持复活水中含菌量在10⁸cfu/mL~10¹⁰cfu/mL；步骤F:将香蕉茎叶切成2-4cm大小，处理至其含水量在60%~65%左右，将步骤E所得的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀，装入发酵桶中，压实、密封后在常温下避光，即可制得香蕉茎叶青贮饲料。本发明采用以上方法，可以变废为宝，能清除和钝化香蕉茎叶中不利于消化的单宁，降低纤维素含量，开发出优质的青贮饲料，产生巨大的经济效益。

主权项

一种制备用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂包括：植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母冻干粉剂和单宁酶冻干粉剂，所述方法包括以下几个步骤：步骤A: 制备植物乳杆菌冻干菌剂：将植物乳杆菌NL4‑10，接种于MRS培养基中，静置培养至稳定期，离心后去上清液，菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，离心后重悬于无菌磷酸盐缓冲液，加入等体积的脱脂乳溶液作为保护剂，预冻，再后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即可获得植物乳杆菌冻干菌剂；步骤B: 制备产朊假丝酵母冻干粉剂：将产朊假丝酵母GIM2.148，接种于麦芽汁培养基中，静置培养至稳定期，离心后去上清液，菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，离心再重悬于无菌磷酸盐缓冲液，加入聚乙二醇和L‑谷氨酸钠的混合溶液作为保护剂，预冻后进行冷冻干燥，即可获得产朊假丝酵母冻干粉剂；步骤C: 制备单宁酶冻干粉剂：将黑曲霉NC22接种于查氏液体发酵培养基培养，定性滤纸过滤后得胞外单宁粗酶液，再离心，上清液为胞外单宁酶液，将得到的上清液加入硫酸铵沉淀，再经蒸馏水透析除盐得到浓缩后的单宁酶液，再将单宁酶液按体积比加入聚乙二醇和甘露醇的混合液作为保护剂，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即可获得单宁酶冻干粉剂；步骤D：依次复活植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母和单宁酶：D1： 植物乳杆菌复活：用水溶解MRS培养基，再加入植物乳杆菌冻干剂，常温下复活；D2：产朊假丝酵母复活：用水溶解麦芽汁培养基，加入产朊假丝酵母冻干粉剂，常温下复活；D3：单宁酶复活：在柠檬酸钠盐酸缓冲液中，加入单宁酶冻干粉剂，常温下复活；步骤E：将步骤D1、D2和D3所得到的复活菌剂充分搅拌后制成复活水，保持复活水中含菌量在10⁸cfu/mL~10¹⁰ cfu/mL；步骤F:将香蕉茎叶切成2‑4cm大小，处理至其含水量在60%~65%，将步骤E所得的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀，装入发酵桶中，压实、密封后在常温下避光，即可制得香蕉茎叶青贮饲料；其中，植物乳杆菌NL4‑10的制备方法：称取50g新鲜香蕉叶，剪成0.5cm小块后装入3cm×20cm的无菌试管中，加入无菌水至没过所有物料，30℃、120r/min 振荡 30min，取悬浮液用于MRS固体培养基平板划线进行分离纯化；挑取单菌落用MRS液体培养基进行培养至培养基浑浊，培养液继续用平板划线进行分离纯化，多次划线分离直至平板菌落无其他杂菌出现；其中，黑曲霉NC22的制备方法：称取 20g 新鲜香蕉叶，粉碎后加入 90mL 0.1%的蛋白胨水溶液中，30℃、120r/min 振荡 30min，过滤得到分离原液，将分离原液进行梯度稀释后涂布于马丁氏琼脂培养基，挑取生长较好的单菌落，接种于PDA 培养基，多次划线分离直至得到该黑曲霉菌株。