利用量子点检测转基因水稻中Bt蛋白的方法

摘要

本发明属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及一种利用量子点检测转基因水稻中转Bt蛋白的快速简便检测方法。该方法包括：以抗CrylAb单克隆抗体为一抗，量子点(QDs)标记羊抗兔IgG为二抗，制备得到CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心，建立了检测水稻Bt蛋白的双抗夹心荧光免疫吸附测定法，该方法对CrylAb标准蛋白的浓度最低可检值为9pg/mL，线性检测范围为6～200pg/mL，回收率在91.6～105.9，变异系数在3.0～12.6。本发明的量子点双抗夹心荧光免疫吸附测定法适合转基因水稻的定量检测，其特点是快速、简单和高灵敏度高。

主权项

一种检测转基因水稻中CrylAb蛋白的快速简便方法，其特征在于如下步骤：(1)抗Cry1Ab单克隆抗体的制备以Cry1Ab蛋白为抗原获得兔血清，通过纯化得到抗Cry1Ab单克隆抗体作为一抗，分泌Cry1Ab蛋白的抗Cry1Ab单克隆抗体的杂交瘤细胞株HHX‑001保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：C201214。(2)CdSe/ZnS量子点标记的羊抗兔IgG抗体的制备1)将500μL羊抗兔IgG抗体溶液分装成10等份的50μL小管子，保存于‑20℃冰箱内，待用时取出一小管，置于4℃冰箱处，备用；2)取25μL CdSe/ZnS量子点母液，20μL1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)端二亚胺盐酸盐溶液和10μLN‑羟基琥珀酰亚胺溶液，pH7.0，混合反应5min，再加入0.2mg羊抗兔IgG抗体溶液，加无菌水配成100μL的标记物溶液，在常温下反应2‑4h；将上述标记物溶液置磁力搅拌器中混匀，反应结束后置于4℃冰箱内过夜，得到CdSe/ZnS量子点标记的羊抗兔IgG抗体粗品；3)将CdSe/ZnS量子点标记的羊抗兔IgG抗体粗品100μL用加样枪放入含有超滤膜的样品储存管中，在另一个管子中放入等量的水作为平衡，在转速为10,000rpm，离心时间为20min，离心温度为4℃的离心机中离心；4)在步骤3)离心结束后，加入PBS缓冲液，按步骤3)的条件重复离心一次；5)在步骤4)离心结束后，向样品储存管中加入100μL PBS缓冲液，然后将其倒扣在离心管上，在转速为500rpm，时间为3min，温度为4℃的离心机中离心并回收样品，即为二抗；(3)CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心的制备以抗Cry1Ab单克隆抗体为一抗，将该一抗与包被缓冲液按体积比1:1000稀释，然后加入到酶标板孔中，20℃孵育过夜，次日用PBS缓冲液洗板3次，每次5min，拍干后加封闭缓冲液，每孔200μL，于37℃下静置1h，之后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min；将Cry1Ab蛋白溶液用PBS缓冲液稀释至6.0pg/mL、12.5pg/mL、25.0pg/mL、50.0pg/mL、100.0pg/mL、200.0pg/mL梯度浓度后加于包被孔中，每孔100μL，于37℃下静置1h，之后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；再加入抗Cry1Ab兔多克隆抗体，最后将纯化后的CdSe/ZnS量子点标记的羊抗兔IgG抗体用PBS缓冲液稀释至10.00μg/mL，每孔100μL加入酶标板的包被孔内，于37℃下静置1h，之后用PBS缓冲液快速洗涤，得到CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心；(4)绘制CrylAb蛋白的标准曲线将0.4μg/mL的CrylAb蛋白标准溶液稀释为200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL和6pg/mL梯度浓度，用CdSe/ZnS量子点标记的抗CrylAb蛋白双抗体夹心检测水稻CrylAb蛋白的含量，以该梯度浓度稀释的CrylAb蛋白溶液浓度为自变量，以对应的CrylAb蛋白相对荧光强度值减去空白对照相对荧光强度值为应变量，绘制标准曲线，公式如下：Y＝0.0137X+0.02 R²＝0.994，X为系列梯度稀释的CrylAb蛋白溶液浓度为自变量，Y为对应CrylAb蛋白相对荧光强度；(5)用酶标仪检测OD₄₅₀的值，判定待检测水稻中CrylAb蛋白的含量；其中：所述的CdSe/ZnS量子点母液的组分及配制：称取0.0127g，0.1mmol的CdO和0.11g的硬脂酸放入50mL的三颈瓶中,在氩气保护下，加热至130℃，使CdO充分溶解于硬脂酸中；将温度降至室温后，称取三辛基氧化磷和十六烷基胺各1.5g放入三颈瓶中,搅拌加热到230℃，另称取0.032g，1mmol的硫粉，在氩气保护下，使之溶解于2mL三辛基磷中，抽入5mL的针管中作为储备液；当Cd前驱物温度达到230℃时，将Se粉储备液快速注入三颈瓶后，使温度降至180℃，保持10min，收集CdSe样品溶于氯仿中备用；称取0.632g的硬脂酸锌和0.032g的硫粉分别加入2mL的十八碳烯中加热至120℃充分溶解，分别得到硬脂酸锌溶液和硫粉溶液，降温至70℃，将硬脂酸锌溶液和硫粉溶液混合后于70℃下保存备用；将分散于氯仿中的CdSe样品加入瓶中,加热至120℃保持30min，蒸干氯仿，升温至200℃；抽取硬脂酸锌和硫粉的十八碳烯溶液，以0.2mL/min注入ZnS壳层，注入完成后,升温至230℃保持1h，降温至60℃,反应产物用甲醇纯化，离心清洗三次，得到CdSe/ZnS氯仿溶液；取CdSe/ZnS氯仿溶液、巯基丙酸和去离子水各1mL放入瓶中混合，强烈搅拌3h，抽取上层水溶液，加甲醇离心清洗三次，后分散于1mL去离子水中即获得CdSe/ZnS量子点母液；其中：PBS缓冲液组分及配制：KH₂PO₄0.2g，NaCl8.0g，KCl0.2g，Na₂HPO₄2.9g，Tween‑200.5mL，加蒸馏水定容至1L，调pH至7.4；包被缓冲液组分及配制：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加蒸馏水定容至1L；封闭缓冲液组分及配制：将牛血清白蛋白0.1g溶于100mL PBS缓冲液中。