一种制备L-高苯丙氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种以高苯丙氨酸脱氢酶为生物催化剂制备单一光学纯L-高苯丙氨酸的工艺方法，具体包括以下步骤：在反应液中加入底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，振荡或搅动反应后从反应体系中过滤直接得到L-高苯丙氨酸产物，滤液循环用于下一轮反应，反应温度为15～40℃。本发明利用高苯丙氨酸脱氢酶，配合辅酶循环再生体系，采用简单过滤循环工艺制备L-高苯丙氨酸，底物浓度达到560mM，所需的辅酶NAD⁺浓度较低，并且可循环多次使用而达到忽略辅酶成本的水平，得率超过95％，具有重要应用价值。

主权项

一种制备L‑高苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向反应液中加入底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶以及由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，配制得到反应体系；所述反应液为水或pH为7.0~9.0的缓冲液；所述底物为2‑氧代‑4‑苯基丁酸或其酯，其结构式为：，其中R为H或C_1~2的烷基，底物浓度为10 mM~680 mM；所述甲酸铵和底物摩尔比为1∶1~10∶1；所述高苯丙氨酸脱氢酶的浓度大于等于5U/mL，高苯丙氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比例为0.8~1.0∶1；所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD⁺浓度大于等于0.1 mM；(2)步骤(1)所得反应体系在振荡或搅拌条件下，用盐酸、硫酸、醋酸、甲酸、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水调节反应体系溶液pH至7.0~9.0，于15~50 ℃下，反应制备L‑高苯丙氨酸，反应完成后过滤分离L‑高苯丙氨酸和滤液，得到L‑高苯丙氨酸；在保持反应进行的同时，补加底物；补加底物的方式选自：一次性加入底物或底物高浓度储液、分批加入底物或底物高浓度储液、连续加入底物或底物高浓度储液中的一种；并且保持反应体系中的底物浓度小于等于680 mM；其中，所述底物高浓度储液的配制方法选自以下两种中的任意一种：[a] 将甲酸铵和底物按照摩尔比为1∶1~10∶1溶于pH值为7.0~9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0~9.0，配制得到底物和甲酸铵的混合溶液，并且底物浓度小于等于850mM；[b] 将底物和助溶剂混合溶于pH值为7.0~9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7.0~9.0，配制得到的底物储液浓度小于或等于2191mM；(3)循环利用滤液，向滤液中补加底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶；用盐酸、硫酸、醋酸、甲酸、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水调节反应体系溶液pH至7.0~9.0，振荡或搅拌条件下，于15~50 ℃下，反应制备L‑高苯丙氨酸，重复该步骤直至转化率低于90%；其中，高苯丙氨酸脱氢酶补加的量为步骤(1)中高苯丙氨酸脱氢酶用量的一半，甲酸脱氢酶补加的量为步骤(1)中甲酸脱氢酶用量的一半；补加后，底物浓度为10 mM~680 mM；所述甲酸铵和底物摩尔比为1∶1~10∶1。