一种检测食品中大肠杆菌的酶联免疫方法

摘要

一种检测食品中大肠杆菌的酶联免疫方法，属于免疫分析领域。本发明应用大肠杆菌E.coliO146(ATCC8739)，购自医学微生物菌种保藏管理中心，菌体免疫8周龄的BALB/c小鼠，经过正常的免疫、细胞融合、筛选后得到5株大肠杆菌E.coli单克隆抗体。5株单抗分别标记辣根过氧化物酶（HRP）并进行两两配对。分别以1号单抗CGMCC No.7202为包被抗体、2号单抗CGMCC No.7203为酶标抗体，以大肠杆菌E.coli为标准品建立了大肠杆菌E.coli的夹心ELISA分析方法，LOD为4.8×10⁵cfu/mL，R²=0.99。本发明采用大肠杆菌E.coli作为免疫原，制备了理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的大肠杆菌E.coli单克隆抗体，建立的夹心法为食品中E.coli菌的检测提供了快速、高效的分析手段。

主权项

一种检测食品中大肠杆菌E.coli的酶联免疫方法，其特征在于包括以下步骤：（1）大肠杆菌E.coli单克隆抗体的制备    以加热灭活的大肠杆菌E.coli为免疫原，进行免疫、融合、筛选，共筛选到5个细胞株；所述大肠杆菌E.coli 为E.coli O142，保藏号为CMCC 44737，购自中国医学微生物菌种保藏管理中心；（2）单克隆抗体的配对筛选将纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度100ng/mL，标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS；酶标抗体稀释500倍使用，在此条件下，实验成功得到了5对P/N值>2.1的配对；（3）夹心法的建立选择检测限最稳定的配对，即以CGMCC No.7202抗体为包被抗体，以CGMCC No.7203抗体为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：抗体包被浓度：5μg/mL，包被液：pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液，标品稀释液：pH7.2、0.01M的PBS，酶标抗体浓度：4μg/mL，反应时间：包被、封闭：37℃ 2h；标准品：37℃ 1h；酶标抗体：37℃ 1h；显色12min；优化后大肠杆菌E.coli夹心法，LOD=4.8*10⁵cfu/mL。