金华猪耳真皮成纤维细胞系的构建方法

摘要

本发明的目的在于提供一种金华猪耳真皮成纤维细胞系的构建方法，便于提取稳定，无污染的细胞系。为了实现所述目的，本发明金华猪耳真皮成纤维细胞系的构建方法，包括活体采集、分离培养等步骤进行培养。由于采用了所述技术方案，本发明利用酶消化与原代外植相结合的方法，成功启动了猪耳真皮成纤维细胞的原代培养，成功建立了金华猪耳真皮成纤维细胞系。

主权项

金华猪耳真皮成纤维细胞系的构建方法，其特征在于,包括以下步骤：（1）活体采集3‑5日龄金华猪耳缘皮肤组织,先剪掉仔猪耳部周围的皮毛，用75％的酒精充分清洗消毒，无菌条件下剪取大小为0.5cm×0.5cm耳部皮肤，将它置于含有双抗的PBS液中，在2小时内进行分离培养；（2）将步骤（1）中采集耳缘皮肤组织样本转移至含双抗的PBS液培养皿中，用眼科剪剪除表面毛发后，置于75％的酒精浸泡45秒，用含有双抗的PBS液，反复漂洗3—5次，直到漂洗液清亮透明为止，吸去PBS液，加入约10ml0.25%胰蛋白酶，4℃消化过12小时后，用镊分离皮肤表层与真皮层，将其剪成0.5‑1mm³大小的组织块；用吸管将组织块转移至50ml离心管内，注入新鲜含双抗的PBS溶液，重复洗涤3遍，去掉最后1次的洗涤液，将离心管置于冰上备用；向离心管内加入37℃预温的培养基2ml，用无菌吸管将组织块转移至处理过的专用培养瓶中，并均匀铺开在培养瓶中，每小块间距5mm，吸去多余的培养液，将培养瓶倒置，加培养液3ml放入37℃、5%CO₂培养箱中4小时，待组织块充分吸附于培养瓶底部后，轻轻翻转培养瓶，让培养液落过组织块，再慢慢加入37℃预温的培养液5ml，重新正置于5%CO₂浓度饱和湿度培养箱中进行原代培养，每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，约5天外植块周围迁移出少量的细胞，每三天更换等量的完全培养液；所述的完全培养液为含100U/ml青霉素钠、100ug/ml硫酸链霉素、8ug/mlTylosin和10%FBS的DMEM培养液；（3）将步骤（2）所得的原代细胞增殖至铺满瓶壁的80‑90％，吸除瓶内的旧培养液，用预热37℃的PBS清洗细胞，以除去残余的血清和脱落的组织块及死细胞，重复2次，PBS应沿着细胞生长面的对面瓶壁注入，向培养瓶非细胞贴壁面加入0.25％胰蛋白酶溶液1.5ml，以能覆盖细胞层为宜，将培养瓶置于37℃温箱中预热2min,取出培养瓶倒置显微镜下观察，再消化大约1min后，发现细胞胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大时，立即加入完全培养基5ml，终止消化；用吸管吸取培养基反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱落形成细胞悬液，用PBS液洗2次，按1：2的比例分瓶，放回培养箱继续培养；（4）选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入冻存培养液并分装至无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于4℃1h、‑20℃2h、‑72℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞。