一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法

摘要

本发明公开了一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法，包括如下步骤：(1)绘制木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线；(2)饲料中木聚糖酶浸提液的制备；(3)酶解反应；(4)根据标准曲线计算饲料中木聚糖酶的酶活力。本发明的优点是木聚糖酶在饲料中提取的整个过程的活力损失较小，在10％以下，可实现高通量分析，操作简便易行。该活力测定方法的灵敏度明显高于DNS法。

主权项

一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法，包括如下步骤：(1)绘制木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线：分别取6‑15组不同浓度的木糖标准溶液与具有相同木聚糖浓度的木聚糖溶液等体积混合而得浓度0‑0.03mg/mL(试管法)或0‑0.08mg/mL(微孔板法)的木糖溶液，其中0‑0.03mg/mL的木糖溶液用于试管法测定体系，0‑0.08mg/mL的木糖溶液用于微孔板法测定体系，然后根据测得的木糖吸光度值与木糖浓度之间的关系绘制标准对应关系曲线；对于木聚糖和饲料本身还原性物质含量较高的情况，在测定时使用较短光程的比色皿进行测定，或者用水将不同浓度的所有木糖的显色产物进行按比例稀释到1‑3倍，从而得到相应的木糖吸光度值与木糖浓度之间的对应关系曲线，以此作为酶活力测定的计算依据；(2)饲料中木聚糖酶浸提液的制备：以下操作均要求在0‑10℃进行，粉碎含木聚糖酶的饲料使其全部通过40‑80目筛，充分混合，从中精密称取1.0000‑2.0000g饲料样品于锥形瓶中，加入50ml缓冲液，于60‑150rpm的摇床中振摇或用混合器间歇混匀30‑60分钟，取出在8000rpm离心15分钟得上清液即为样品的木聚糖酶浸提液，将浸提液按比例稀释至一定浓度即可用于酶活力测定，对于饲料本身还原性物质较高的情况，将浸提液透析或超滤截留分子量在1万道尔顿以上后再稀释至一定浓度用于测定；(3)酶解反应：将预热至所设定酶解温度25‑40℃的木聚糖溶液与预热至同一温度的木聚糖酶浸提液等体积充分混匀，起始酶解反应，准确计时，酶解时间为30‑60分钟，取水解液迅速加入到等体积的0.5N NaOH溶液中，充分混匀至终止反应，进行还原糖浓度的测定，此酶活力测定过程在试管法测定体系或微孔板法测定体系中完成，试管法的用量是微孔板法的10‑20倍；(4)根据从步骤(1)中所得到的标准曲线计算木聚糖酶的酶活力，木聚糖酶的活力单位被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1nmol相当于木糖所需的酶量为一个酶活力单位，计算公式如下：$U/g=\frac{50\times c}{m\times t}\times N;$其中：U‑样品木聚糖酶的活力，U/g；C‑样品溶液实测吸光度值在标准曲线中对应的还原糖浓度，nmol/mL；50‑用于溶解饲料的缓冲液的体积，mLN‑样品溶液在酶解体系中的总稀释倍数；m‑样品质量，g；t‑反应时间，min。