一种拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建方法，用TRIzol法提取拟南芥幼苗的总RNA，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，为2.014；将PCR产物进行凝胶回收，回收后的产物与PMD-18T载体进行连接，转化结束后进行质粒的提取，将提取的质粒进行PCR及酶切验证，经过质粒PCR验证，获得了1600bp的DNA条带；测序后发现该基因ORF1458bp，编码485个氨基酸的多肽，用限制性内切酶EcoR I和Xba I将目的基因和pCAMBIA3300载体分别酶切后，将目的基因定向连接到植物表达载体上，经转化结束后进行质粒的提取，将质粒进行PCR及酶切验证；质粒PCR验证，获得了一条为1600bp的DNA条带；经过酶切验证，分别获得了8300bp的pCAMBIA3300载体与为1600bp的目的片段；说明载体构建成功，重新命名为p3300-AAP1。

主权项

一种拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)用TRIzol法提取到拟南芥幼苗的总RNA，反转录成cDNA后，根据Primer5.0设计引物进行RT‑PCR，上游引物带有EcoR I酶切位点，下游引物带有Xba I酶切位点：上游引物：5’CGGAATTCATGAAGAGTTTCAACACAG3’下游引物：5’GCTCTAGATTGGAAGAGCTCATATGTAT3’2)将PCR产物进行凝胶回收，回收后的产物与PMD‑18T载体进行连接，转化结束后进行质粒的提取，将提取的质粒进行PCR及酶切验证，经过质粒PCR验证，获得了1600bp的DNA条带；经过双酶切验证，分别获得了2692bp的载体与1600bp的目的片段，可初步证明，已经成功克隆出拟南芥AAP1基因；3)获得1600bp左右的目的条带，测序后发现该基因ORF1458bp，编码485个氨基酸的多肽，根据氨基酸序列推出，该基因编码一个氨基酸透性酶；在线对蛋白氨基酸序列进行疏水性分析，此程序采用的是Kyte&Doolittle(K‑D)法计算氨基酸的亲水性或疏水性；程序中分析得知，第460氨基酸处具有疏水性较强的特性，在第37个氨基酸和360‑370氨基酸左右区域具有较强的亲水性；4)用限制性内切酶EcoR I和Xba I将目的基因和pCAMBIA3300载体分别酶切后，将目的基因定向连接到植物表达载体上，经转化结束后进行质粒的提取，将质粒进行PCR及酶切验证；质粒PCR验证，获得了一条为1600bp的DNA条带；经过酶切验证，分别获得了8300bp的pCAMBIA3300载体与为1600bp的目的片段；重新命名为p3300‑AAP1。