噬菌体免疫环介导等温扩增检测法

摘要

本发明涉及一种噬菌体免疫环介导等温扩增检测法，首先将噬菌体展示多肽与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点，然后环介导等温扩增结合在捕获抗体上的噬菌体，最后对免疫环介导等温扩增反应产物进行分析及结果判定。本发明提供的方法利用噬菌体展示多肽，将免疫竞争和环介导等温扩增结合，实现对不含有核酸的小分子化合物的环介导等温扩增检测。本发明灵敏度高、实用性强，不需要昂贵的精密仪器。

主权项

一种噬菌体免疫环介导等温扩增检测法，其特征包括：第一步：噬菌体展示多肽与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点，包被：用PBS缓冲液将抗体稀释为10μg/mL后加入酶标板，每孔100μL，37℃孵育2小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；封闭：每孔加入300μL1％BSA，37℃孵育1小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；加入分析物和噬菌体：每孔加入50μL分析物，再加入50μL的噬菌体，37℃孵育1小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；洗脱：每孔加入100μL0.2M pH2.2甘氨酸盐酸缓冲液37℃洗脱15分钟，洗脱后收集洗脱液并用1M pH9.1Tris‑HCl进行中和。第二步：环介导等温扩增结合在捕获抗体上的噬菌体，以FIP、BIP为内引物，以F3、B3为外引物对洗脱的噬菌体进行恒温扩增。其反应体系为：0.64M betaine，1mM dNTPs，2.5μL 10×Bst Buffer，8U Bst DNA聚合酶，150μM羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue，HNB)，2μL中和后的噬菌体洗脱液，外引物各0.2μM，内引物各1.2μM，ddH₂O补齐至25μL。将上述所有试剂混匀置于PCR管中，63℃ 60min，80℃ 10min终止反应。第三步：免疫环介导等温扩增反应产物分析及结果判定，分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取3μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(W/V)琼脂糖凝胶中101V下电泳1小时，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成像系统上成像；分析方法2：在日光下用肉眼观察结果。结果判定：在分析方法1中，在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，若有条带为阴性，若无条带为阳性。在分析方法2中，若扩增产物的颜色变为天蓝色则为阴性，若保持深蓝色不变为阳性。