检测Galectin-3的时间分辨免疫荧光试剂盒

摘要

检测Galectin-3的时间分辨免疫荧光试剂盒。试剂盒包括：包被缓冲液；封闭液；洗涤液；加样缓冲液；荧光增强液；检测缓冲液；包被抗体（单克隆小鼠抗人Galectin-3抗体）；检测抗体（生物素化的羊抗人Galectin-3多抗）；Eu^3＋标记的链亲和霉素；标准品（重组人Galectin-3蛋白）。其使用包括：该试剂盒采用双抗体夹心法和时间分辨免疫荧光原理来检测样品中的Galectin-3蛋白的浓度。在酶标板中包被抗体包被，封闭后加入待测样品孵育，洗板，加入检测抗体孵育，再次洗板后加入Eu^3＋标记的链亲和霉素孵育，然后洗板加入荧光增强液，振荡5分钟后用337nm波长光激发，延时200微秒在615nm波长处检测发射荧光值；通过标准品的浓度和相应的荧光值绘制标准曲线，待检样品中的Galectin-3浓度就可以通过它的荧光值并对应标准曲线得到。

主权项

检测Galectin‑3的时间分辨免疫荧光试剂盒的使用方法，其特征在于：所述检测Galectin‑3的时间分辨免疫荧光试剂盒包括以下组成（1）包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl， 10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH值为7.4；（2）封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；（3）洗涤液为含0.05%Tween‑20的Tris‑HCl 缓冲液，其成分为50mM的Tris‑HCl 缓冲液，0.05%Tween‑20，pH 7.8；（4）加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；（5）荧光增强液；（6）检测缓冲液为50mM的Tris‑HCl 缓冲液，pH 7.8，其中含有1%BSA，1%bovine globulin，0.05%Tween 40，二乙烯三胺五乙酸； （7）包被抗体为单克隆小鼠抗人Galectin‑3抗体，储存浓度为1μg/μl；（8）检测抗体为生物素化的羊抗人Galectin‑3多抗，储存浓度为50ng/μl；（9）Eu^3＋标记的链亲和霉素，储存浓度为0.1μg/μl；（10）标准品，重组人Galectin‑3蛋白，浓度为100μg/μl；所述使用方法具体为以下步骤（1）用PBS稀释包被抗体－单克隆小鼠抗人Galectin‑3抗体至浓度为4μg/ml，以100μl/孔加入96孔酶标板，4℃过夜；（2）弃去包被抗体，300μl/孔洗涤液洗涤三次，加入封闭液200μl/孔，37℃孵育1h；（3）弃去封闭液，300μl/孔洗涤液洗涤三次，加入待测培养上清样品和倍比稀释的标准品100μl/孔，37℃孵育1h；（4）弃去样品和标准品，300μl/孔洗涤液洗涤三次；（5）用加样缓冲液稀释检测抗体－生物素化的羊抗人Galectin‑3多抗至浓度为75ng/ml，以100μl/孔加入稀释好的检测抗体，37℃孵育1h；（6） 弃去检测抗体，300μl/孔洗涤液洗涤三次；（7）用检测缓冲液稀释Eu^3＋标记的链亲和霉素，终浓度为500ng/ml ，以100μl/孔加入酶标板，37℃避光孵育1h；（8） 弃去Eu^3＋标记的链亲和霉素，300μl/孔洗涤液洗涤四次（9） 加入荧光增强液200μl/孔，室温避光缓慢水平摇动5min；（10） 读板：设定激发光波长为337nm，发射光波长为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；（11）利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；（12）通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的Galectin‑3的浓度。