固相萃取和气相色谱联用测定结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的方法

摘要

一种固相萃取和气相色谱联用测定结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的方法，先利用纯的花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亚麻酸-甘油一酯、油酸-游离脂肪酸标准品，通过优化不同极性配比的洗脱液洗脱条件，在同一根SPE小柱上实现混合物中TAG、DAG、MAG、FFA的有效分离，其特征在于它包括如下步骤：1)混合标准样品的分离和脂肪酸组成分析；2)结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的分析。该方法具有操作简便、样品需求量低、需要溶剂消耗量少、定性定量分析结果准确、检测限低、分析时间快的优点，可实现结构脂α、β位置脂肪酸组成和结构脂产品中TAG、DAG、MAG、FFA组成与含量的高通量检测。

主权项

一种固相萃取和气相色谱联用测定结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的方法，其特征在于它包括如下步骤：1)混合标准样品的分离和脂肪酸组成分析(1)样品制备：分别称取花生四烯酸‑甘油三酯、二十二碳六烯酸‑甘油二酯、亚麻酸‑甘油一酯、油酸‑游离脂肪酸标准品，按花生四烯酸‑甘油三酯：二十二碳六烯酸‑甘油二酯：亚麻酸‑甘油一酯：油酸‑游离脂肪酸的质量比为5‑50mg:5‑50mg:5‑50mg:5‑50mg，混合，用正己烷溶解，质量浓度控制在5mg/mL～50mg/mL之间，得到样品，并置于‑20℃冰箱保存；(2)柱子活化：将固相萃取小柱置于固相萃取装置上，用5‑10倍固相萃取小柱内的填料体积的正己烷对柱子进行平衡活化；固相萃取小柱内填料为弗罗里硅土；(3)上样：将步骤(1)中配制的样品转移到固相萃取小柱中，样品上样体积为固相萃取小柱内的填料体积的1‑2倍，控制流速<5mL/min；(4)洗脱：用不同极性配比的洗脱液正己烷：无水乙醚＝85：15、70：30、25：75(v/v)，无水乙醚：冰醋酸＝95：5(v/v)分别淋洗柱子，分别收集洗脱液，氮吹仪下吹干洗脱液，得洗脱物；(5)TLC检测：向步骤(4)收集的洗脱物中加入正己烷，质量浓度控制在5mg/mL～50mg/mL之间，涡旋混匀，得洗脱样品；取洗脱样品点样于硅胶板，置于层析缸中进行薄层层析，所用展层剂为正己烷：无水乙醚：冰醋酸＝50：50：1(v/v/v)，自然晾干后，置于碘蒸汽中显色至斑点完全显现，观察花生四烯酸‑甘油三酯、二十二碳六烯酸‑甘油二酯、亚麻酸‑甘油一酯、油酸‑游离脂肪酸是否实现分离，并确定各洗脱物的类型；(6)GC检测：将步骤(4)收集的洗脱物进行甲酯化衍生化处理，根据步骤(5)的结果判断洗脱物的种类，对于脂肪酸的甲酯化反应采用浓H₂SO₄/甲醇加热法进行，对于甘油酯的甲酯化反应采用KOH/甲醇法进行；取步骤(5)洗脱样品50μL，溶于2mL石油醚，振荡1‑2s，加入1mL5％(v/v)的浓H₂SO₄/甲醇溶液或者1mL0.4mol/LKOH/甲醇溶液，涡旋5min，然后加入2mL0.9％(w/v)的氯化钠水溶液，轻微振荡5‑10秒，5000rpm离心5min，最后取上清液进行GC分析；得GC色谱图，数据分析，计算各脂肪酸的百分含量；(7)根据步骤(6)中脂肪酸组成，结合步骤(5)中各洗脱物的类型，得到甘油三脂、甘油二酯、甘油一酯和游离脂肪酸的脂肪酸组成；2)结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的分析(1)对于结构脂α、β位置脂肪酸组成的分析，称取300mg结构脂于30mL玻璃试管中，加20mg猪胰脂酶，2mLTris‑HCl缓冲液，摇匀后，加0.5mL胆酸钠溶液，0.2mLCaCl₂溶液，涡旋混匀后，于40℃水浴锅中震荡反应5min后，加入1mL无水乙醚，1mLHCl溶液，震荡均匀后，5000r/min离心2min，取上层，氮吹吹干得样品；(2)将步骤(1)中的样品按步骤1)中(2)‑(6)进行，根据猪胰脂酶对α位置脂肪酸水解的专一性，得到甘油一酯和游离脂肪酸的组成，确定结构脂α、β位置的脂肪酸组成；(3)对于结构脂甘油酯组成的分析，其样品按步骤1)中(2)‑(7)进行，确定甘油酯的组成。