猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法

摘要

本发明提供了猪传染性胃肠炎TGE的RT-LAMP检测方法，包括如下具体步骤：1）根据GenBank中TGEVN基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物；2）制备病毒液，-80℃备用；3）提取TGEV的RNA；4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，进行RT-LAMP反应；5）琼脂糖凝胶检测RT-LAMP反应结果。本发明所述猪猪传染性胃肠炎TGE的RT-LAMP检测方法与传统方法相比，具有以下优点：1.操作简单。2.快速高效。3.高特异性。4.高灵敏度。

主权项

猪传染性胃肠炎TGE 的非诊断RT‑LAMP检测方法，其特征在于，其包括如下具体步骤：1）根据GenBank中TGEV N基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物如下： FIP 5’GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA3’BIP 5’CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC3’F3 5’GCTATCGCATGGTGAAGG3’B3 5’CAAGTTGAAATTCGCCTGG3’；2）用常规方法将PK‑15细胞传代培养，待其长成单层，将TGEV Purdue株冻干毒用DMEM稀释后接种于细胞上，在37℃，5% CO₂ 培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于37℃，5% CO₂培养箱中，待细胞出现明显病变，刮取细胞收获病毒液，‑80℃备用；3）提取 TGEV的RNA；具体步骤为：3‑1 )用移液器将20µL蛋白酶K加入一个干净的1.5 mL离心管中;3‑2) 向离心管中加入200µL步骤2）获得的病毒液；3‑3)加入200µL Carrier RNA工作液盖上管盖，涡旋振荡15秒混匀；为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀；Carrier RNA工作液为缓冲液GB与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法按照公式计算, 配制公式为：n×0.22mL=y mL y mL×28 uL/mL=zµLn=同时提取的样品个数y=需要加入缓冲液GB的体积z=需要加入Carrier RNA3‑4) 在56℃孵育15分钟；简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；3‑5) 加入250µL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15秒，在15‑25℃放置5分钟；如果周围环境高于25℃，乙醇需要再在冰上预冷后再加入；3‑6) 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；3‑7) 将RNase‑free吸附柱CR2放在收集管中，仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase‑free吸附柱CR2，盖上管盖，8000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；3‑8)小心打开吸附柱盖子，加入500µL溶液RW，盖上管盖，静置2分钟，8000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管；3‑9) 重复3‑8)步骤一次；3‑10)小心打开吸附柱盖子，加入500µL无水乙醇，盖上管盖，8000 rpm离心1分钟，弃废液；3‑11)将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液；3‑12) 将吸附柱放入一个RNase‑free的1.5 ml离心管中，小心打开吸附柱的盖子，向膜中央加入20‑150ul RNase‑free ddH20，盖上盖子，室温放置5分钟12,000 rpm离心1分钟;离心结束后，离心管中收集液即为TGEV病毒基因组RNA；4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，按照下述条件进行RT‑LAMP反应：10×Bst buffer 2.5µL、5U/µL AMV0.5µL、Bst DNA 聚合酶8U、1mol/L Betaine 3µL、250µmol/L Calcein 3µL、25mmol/L MnCl₂ 0.5µL、100mmol/L MgSO₄ 0.5µL、10mmol/mL BIP 3µL、10mmol/mL FIP 3µL、10mmol/mL LB 2µL、10mmol/mL F3 0.5µL、10mmol/mL B3 0.5µL、10mmol/L dNTPs 3µL、7.28µg/µL模版RNA 2µL，用去离子水补足25µL；反应条件为：62℃1h，80℃10min；5） 可视化观察RT‑LAMP反应结果；6）琼脂糖凝胶验证可视化RT‑LAMP反应结果。