一种FRET效率定量检测方法

摘要

本发明公开了一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其涉及一种定量检测方法，特别是涉及一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，本发明通过部分光漂白受体，用供体、受体两种激发光交替激发样品，采集受体部分光漂白前后供体通道和受体通道的荧光强度，即可定量获得供体-受体对的FRET效率。该方法直接对待测样品进行检测，不需要任何辅助样品和额外的系统校正与补偿，不仅可以定量检测供体受体浓度比为1:1时FRET效率,而且还可以有效解决一个供体与多个受体存在时的FRET效率定量检测。该方法操作简单，对样品光损伤小，可以对同一个样品进行多次重复检测，可应用于样品中供体受体对FRET效率的快速定量检测中。

主权项

一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其特征在于：包括先检测供体再检测受体方法或先检测受体再检测供体方法的处理步骤，其中先检测供体再检测受体方法处理步骤包括：A：选用供体激发光激发供体受体对，用供体通道采集供体发射的荧光强度，记为I_DD′；B：选用受体激发光仅激发受体，用受体通道采集受体发射的荧光强度，记为I_AA′；C：利用最大强度的受体激发光漂白部分受体；D：选用供体激发光激发漂白后的供体受体对，用供体通道采集供体发射的荧光强度，记为E：选用受体激发光仪激发漂白后的受体，用受体通道采集受体发射的荧光强度，记为F：计算部分受体光漂白前后供体通道荧光强度的增加量ΔI_DD′及受体通道荧光强度的减少量ΔI_AA′：$\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }=I_{\mathrm{DD}}^{\mathrm{post}\prime }-{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime };$$\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }={I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }-I_{\mathrm{AA}}^{\mathrm{post}\prime };$G：计算先检测供体再检测受体方法所得的漂白区域FRET效率E′：$E^{\prime }=\frac{\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}}{\frac{\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }}{{I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }}+\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}};$先检测受体再检测供体方法处理步骤包括：A1：选用受体激发光仅激发受体，用受体通道采集受体发射的荧光强度，记为I_AA″；B1：选用供体激发光激发供体受体对，用供体通道采集供体发射的荧光强度，记为I_DD″；C1：利用最大强度的受体激发光漂白部分受体；D1：选用受体激发光仅激发漂白后的受体，用受体通道采集受体发射的荧光强度，记为E1：选用供体激发光激发漂白后的供体受体对，用供体通道采集供体发射的荧光强度，记为F1：计算部分受体光漂白前后供体通道荧光强度的增加量ΔI_DD″及受体通道荧光强度的减少量ΔI_AA″：$\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }=I_{\mathrm{DD}}^{\mathrm{post}\prime \prime }-{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime };$$\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }={I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }-I_{\mathrm{AA}}^{\mathrm{post}\prime \prime };$G1：计算先检测受体再检测供体方法所得的漂白区域FRET效率E″：$E^{\prime \prime }=\frac{\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}}{\frac{\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }}{{I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }}+\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}}.$