肝素酶Ⅲ的固定化方法

摘要

本发明涉及一种肝素酶Ⅲ的固定化方法，尤其涉及一种以壳聚糖微球为固定化材料，对肝素酶Ⅲ进行固定化的方法。肝素酶Ⅲ固定化以后具有可回收、可重复利用、酶与底物和产物易分离等优越性。

主权项

一种肝素酶III的固定化方法，包括下述步骤：（1）肝素酶III溶液的制备：选择Tris‑HCl缓冲液作为肝素酶III的溶剂，缓冲液的pH为7.0，含CaCl₂，将肝素酶III溶解在该缓冲液中，制得酶溶液；（2）肝素酶III与壳聚糖微球的交联：将壳聚糖微球用Tris‑HCl缓冲液充分溶胀，缓冲液的pH为7.0，含10mM CaCl₂，再取步骤（1）获得的肝素酶III溶液 ，将其加入该壳聚糖微球中，进行交联；（3）用乙酸‑乙酸钠和Tris‑HCl两种缓冲液分别洗涤上述交联后的壳聚糖微球，至洗脱液无酶活性，其中乙酸‑乙酸钠pH 6.5‑8.0，含NaCl，Tris‑HCl pH 6.5‑8.0，含CaCl₂和NaCl；（4）利用还原剂处理步骤（3）中获得的固定了肝素酶III的壳聚糖微球，随后，除去残余的还原剂，由此得到固定在壳聚糖微球上的肝素酶III；其中上述步骤(2)中壳聚糖微球的制备方法如下: 取市售壳聚糖粉末溶于乙酸中，制得酸性壳聚糖溶胶，将分散剂加入油相中，然后将酸性壳聚糖溶胶加入油相中，乳化之后，加入戊二醛进行交联，交联完毕后加入等体积的NaOH和无水乙醇的混合液，搅拌后静置，弃去油层和水层，并用超纯水反复洗涤，即得壳聚糖微球。