一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒。本发明采用环介导等温扩增（LAMP）技术，根据鸭甲肝病毒3D基因的保守序列设计一对外引物和一对内引物（如SEQ NO.1-4），建立鸭甲肝病毒的的检测试剂盒，包含以下成分：TRIZol；反应液；SYBR Green Ⅰ；阳性对照；DEPC处理水。本发明试剂盒具有操作简便、检测快速、敏感性高、特异性好等优点，特别是对仪器的要求低，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。

主权项

一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒，其特征在于，按50次量计包括以下组分： 1)TRIZol：50ml； 2)反应液：2000μL，包括10×Bst buffer250μL、10mmol/L的dNTP100μL、25mmol/L的MgCl₂300μL、5mol/L的betaine200μL、10μmol/L的外引物DHV‑F3、DHV‑B3各50μL、40μmol/L的内引物DHV‑FIP、DHV‑BIP各100μL、40U/μL的RNA酶抑制剂100μL、5U/μL的反转录酶AMV100μL、8U/μL的Bst DNA聚合酶100μL、DEPC处理水550μL； 3)阳性对照：重组质粒T‑DH250μL，浓度为0.1ng/μL； 4)DEPC处理水：1ml； 各引物如下： 正向外引物DHV‑F3：5'‑ATCTGGYTGTGCTGTTGGRAT‑3'； 反向外引物DHV‑B3：5'‑CATARCAYTGRTTGATGTCATAKCC‑3'； 正向内引物DHV‑FIP：5'‑ACTCARAGABCCATCRAAWCCAGTTTTGAGTGGGAYAATYTGTTRGC‑3'； 反向内引物DHV‑BIP：5'‑CHCAYTATGTAACTGATGAGATHTGGTTTTACAGTRGTRCAKGGDGAT CCTGA‑3'； 其中R＝A或G；Y＝C或T；H＝A,T或C；D＝G,A或T；W＝A或T；B＝G,T或C；K＝G或T； 所述重组质粒T‑DH的详细制备方法为：提取A型鸭甲肝病毒RNA，利用外引物DHV‑F3/DHV‑B3进行RT‑PCR，扩增目的条带，反应条件如下： RT反应体系：10mmol/L dNTP1.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、20pmol/μL的引物DHV‑B31.0μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水11.5μL；置于PCR扩增仪进行反应，5U/μL反转录酶AMV1μL于70℃5min后加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min； PCR反应体系：ddH₂O39μL、20pmol/μL的引物DHV‑F31.0μL、10×PCR缓冲液4.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、RT产物5.0μL；置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃2min预变性；94℃变性15sec、60℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min； 回收目的条带，与载体pMD18‑T连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，PCR鉴定阳性后进行测序，序列正确的质粒标记为T‑DH作为鸭甲肝病毒的阳性对照。