一种增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法

摘要

本发明公开一种增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是将可同时过量表达酪氨酸转氨酶TyrB、甲基紫罗碱外转运蛋白YddG、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶AroG、分支酸变位酶和预苯酸脱水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脱氢酶YdiB的重组质粒转化宿主大肠杆菌，并通过液体发酵生产L-苯丙氨酸，所述重组质粒是将大肠杆菌来源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB编码基因进行人工修饰以解除其所受代谢调控，并插入载体构建而成。本发明可明显增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸产量高，有害副产物乙酸浓度低，发酵成本低廉，工艺简单，适宜产业化生产。

主权项

一种增强大肠杆菌L‑苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于：将可同时过量表达酪氨酸转氨酶TyrB、甲基紫罗碱外转运蛋白YddG、3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖酸‑7‑磷酸合成酶AroG、分支酸变位酶和预苯酸脱水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脱氢酶YdiB的重组质粒转化宿主大肠杆菌，并通过液体发酵生产L‑苯丙氨酸；所述液体发酵条件控制如下：发酵培养基的起始葡萄糖浓度为3~15g/L，发酵过程中的葡萄糖浓度为1~4g/L，发酵温度35~42℃，发酵pH值6.5~7.5，通气量0.5~1.0vvm，溶氧量为初始氧浓度的10~35%，发酵时间48~72h；    所述重组质粒是将大肠杆菌来源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB编码基因进行人工修饰以解除其所受代谢调控，并插入载体构建而成；所述TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB编码基因的天然启动子被其它不受末端代谢产物反馈阻遏的强启动子所替换，以增强其表达水平，所述强启动子包括P_R­和/或P_L启动子；所述TyrB编码基因编码框的起始碱基序列被SEQ ID NO:1所示的碱基序列替换，以解除其与阻遏蛋白TyrR的结合能力；    所述AroG氨基酸序列中第146位的天门冬氨酸被替换成天门冬酰胺，以解除苯丙氨酸对其的反馈抑制；所述PheA的R‑domain结构域被删除，以解除苯丙氨酸对其的反馈抑制。