主权项 |
绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法,其特征在于其具体步骤如下:(1)采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取绿鲍、皱纹盘鲍及其杂交子一代基因组DNA;(2)以所提取的基因组DNA为模板进行多重PCR和常规PCR的平行扩增;多重PCR扩增采用两对特异性引物:引物1:afa142F:CCGTTGAACATGCTCACAGTAR:TAATGGGCACATTCCGTAAAT引物2:DF‑1F:ATCTCAATTAGTGCGACATCACR:CCAGAGCAAACTGATCGACTG常规PCR扩增中采用的特异性引物:引物:DF‑2F:TTCTCTGTTAATTTGTGTGGR:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT;(3)PCR扩增反应程序为:多重PCR反应程序:94℃3min→{94℃30s→[65℃→55℃每个循环降低0.5℃]→72℃20s}×20→{94℃30s→55℃30s→72℃15s}→72℃10min→4℃∞;常规PCR反应程序:94℃3min→{94℃30s→54℃30s→30℃30s}×30→72℃10min→4℃∞;(4)对两个PCR反应扩增产物分别进行凝胶电泳;(5)将电泳图谱与标准图谱进行比对;(6)对电泳结果图谱进行分析,其中:多重PCR中,由引物1扩增出的目的条带为大小在250bp左右皱纹盘鲍特异性的条带,记为条带1‑1,由引物2扩增出的目的条带为大小在500~750bp之间的绿鲍特异性条带,记为条带1‑2;常规PCR中,扩增出的产物是条带为大小在250bp左右的特异性条带,记为条带2‑1;将电泳结果于可见灯箱下观察拍照;电泳图谱进行比对后,只具有条带1‑1的DNA样品,即为皱纹盘鲍样品;只具有条带1‑2的DNA样品,即为绿鲍样品;同时具有条带1‑1及条带1‑2的样品,即同时具有亲本皱纹盘鲍和亲本绿鲍的特异性条带,说明该个体系二者的杂交种;具有条带2‑1的DNA样品,即含有绿鲍线粒体基因特异性片段的DNA样品,能判断是绿鲍样品或以绿鲍为母本的杂交子代;不具有任何条带的DNA样品,即不含有绿鲍线粒体基因特异性片段的DNA样品,能判断是皱纹盘鲍样品或以皱纹盘鲍为母本的杂交子代;同时,具有条带1‑1,条带1‑2,条带2‑1的DNA样品,说明是以绿鲍为母本,皱纹盘鲍为父本的杂交后代,只具有条带1‑1及条带1‑2的DNA样品,说明是以皱纹盘鲍为母本,绿鲍为父本的杂交后代。 |