限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法

摘要

本发明公开一种基于限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶Ⅲ的DNA甲基化及甲基化转移酶活性的检测方法。制备了无标记的DNA探针，该探针序列包含了限制性内切酶的切割位点和甲基化的CpG位点,通过该无标记的DNA探针与目标DNA杂交，用甲基化转移酶进行甲基化处理，再用限制性内切酶HpaⅡ的特异性切割以及作用于双链DNA的3'→5'外切酶活性的核酸外切酶Ⅲ作用，然后利用荧光信号分子噻唑橙对单双链DNA不同信号实现检测甲基化及甲基转移酶活性的目的。本发明无需制备复杂材料和标记DNA探针，可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。

主权项

一种基于限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)无标记的探针DNA和目标DNA的选取：所述无标记的探针DNA和目标DNA部分互补，并且都包含一段能被限制性内切酶识别并切割的5'‑CCGG‑3'特定序列，并且3'尾部分别都多出6个碱基序列；(2)无标记的探针DNA与目标DNA的杂交；(3)甲基化转移酶对双链DNA上CpG位点进行甲基化；(4)对甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶ⅢExoⅢ同时作用DNA；(5)加入荧光信号分子；(6)利用荧光分光度计对产物溶液进行检测。