一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用

摘要

一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用，它涉及一种重组菌株的构建、表达纯化及其应用。本发明要解决现有金针菇免疫调节蛋白工程菌株表达率低，表达产物多为不溶性的包涵体，结构不确定以及菌体破碎、纯化工艺复杂不适合大规模生产应用的问题。本发明将金针菇免疫调节蛋白基因，以Transetta(DE3)作为宿主菌，构建重组菌株；再用IPTG诱导表达，通过溶菌酶法结合超声法处理后采用Ni-His·Band柱层析，Sephadex G25凝胶层析柱方法脱盐，即完成重组菌株的构建及表达纯化。其用于制备预防或治疗过敏症的药物。其纯化过程简单而快速，适于规模化发酵生产。

主权项

获得金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于：按照以下步骤获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的Transetta(DE3)大肠杆菌重组菌株，所述能够表达金针菇免疫调节蛋白的Transetta(DE3)大肠杆菌重组菌株包含有插入了编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA的大肠杆菌表达质粒pET30a（+），使得获得的重组表达质粒在转化到大肠杆菌中时能够表达金针菇免疫调节蛋白：一、采用试剂盒提取金针菇总RNA；二、以步骤一提取的金针菇总RNA为模板，通过反转录PCR试剂盒进行RT‑PCR，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的cDNA；三、将步骤二得到的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a（+）中，得到重组载体pET30a（+）‑FIP‑fve连接产物；四、将步骤三获得的重组载体pET30a（+）‑FIP‑fve连接产物转入Transetta(DE3)大肠杆菌中，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株；将上述重组菌株培养到OD₆₀₀为0.8～1.0，然后加入IPTG诱导金针菇免疫调节蛋白表达，最后分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白；其中，所述的IPTG终浓度为0.2～1mM，所述的分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白的操作步骤包括：（一）、取所述能够表达金针菇免疫调节蛋白的Transetta(DE3)大肠杆菌重组菌株，按体积比为1:10～200的比例接种于LB液体培养基中，加入终浓度为0.2～1mM的IPTG，然后在温度为8℃～37℃，转速为80～280rpm的条件下诱导培养12～48h；（二）、取步骤（一）诱导培养后的金针菇免疫调节蛋白基因重组菌株菌液，在转速为1000～15000rpm的条件下，离心0.5～10min，收集沉淀，然后将收集的沉淀重悬于10～200倍重量的PBS缓冲液中，得菌悬液；（三）、向步骤（二）得到的菌悬液中加入终浓度为0.1mg/mL的溶菌酶，在温度为37℃条件下孵育20min，得菌液；（四）、将步骤（三）中得到的菌液置于冰浴中，在超声功率为200W，间隔时间5s的条件下，超声处理20min；（五）、将步骤（四）超声处理的菌液在温度为4℃，转速为5000～15000rpm的条件下，离心1～30min，收集上清液采用Ni‑His·Band柱层析，然后采用SephadexG25凝胶层析柱方法进行脱盐，用0.02M、pH为7.8的PBS进行洗脱，即获得纯化的表达蛋白溶液，完成分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白；其中，所述的金针菇免疫调节蛋白序列如序列表Seq ID No：2所示。