耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法

摘要

耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，属于生物技术领域。其特征在于包括以下步骤：采集9月初的耐冬山茶果实，消毒、清洗；剥去种子的内外种皮，接种于愈伤诱导培养基；第25-28天将材料转移至愈伤组织过渡培养基上；待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内；材料成型并长至3-4cm的芽条，其基部用IBA浸没处理，然后转到MV液体培养基的纸桥上诱导生根，20-22天开始启动，透明略带红色的幼根长出，再培养一段时间之后，幼根伸长并逐渐木质化。上述耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，为耐冬山茶大规模无性繁殖提供一种周期较短，繁殖系数较高的方法，也为山茶分子育种奠定基础。

主权项

1.耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：1）采集9月初的耐冬山茶果实，剥去果皮，用洗涤剂搓洗种子，再用自来水搓洗至无泡沫，置于培养瓶中，加入75%酒精进行第一次消毒清洗8-12秒，然后纯净水清洗2-3遍，沥干水分，盖上瓶盖，置于无菌超净台备用；2）再次使用75％酒精对种子表面消毒25-35秒，接着使用0.1％HgCl₂浸泡6-10分钟，然后用无菌水冲洗5-6遍，清洗完毕后将种子铺在放有滤纸的平皿里吹干水分，备用；3）剥去种子的内外种皮，接种于愈伤诱导培养基上，培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000Lx，光照时间为10-12h/d；所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6mgL^-12,4-D和1.8-2.2mgL^-16-BA，愈伤诱导培养基中蔗糖含量为2-4%，琼脂0.6-0.8%，灭菌前将pH调至5.7-5.9，120-125℃下灭菌20-25分钟；4）材料接入愈伤诱导培养基后15-18天后开始启动，待第25-28天的时候诱导出的细密的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的一圈，淡黄色，泛着些许绿色、晶莹、剔透，这时再将长有愈伤组织的材料转移至愈伤组织过渡培养基上，培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000Lx，光照时间为10-12h/d；所述的愈伤组织过渡培养基为MS基本培养基中加入0.1-0.15mgL^-1NAA+2.0-2.2mgL^-16-BA；5）材料在愈伤组织过渡培养基内进行培养，待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内，培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000Lx，光照时间为10-12h/d；所述的愈伤组织分化不定芽培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6mgL^-1NAA+9-11mgL^-16-BA或者MS基本培养基中加入0.4-0.6mgL^-1IBA+9-11mgL^-16-BA；6）材料成型并长至3-4cm的芽条，其基部用500-550mgL^-1的IBA浸没处理20-25min，然后转到MV液体培养基的纸桥上在100-200μmolm^-2s^-1的光照强度下诱导生根；诱导生根阶段，采用MV液体培养基加入蔗糖15-20gL^-1，20-22天开始启动，透明略带红色的幼根长出，再培养一段时间之后，幼根伸长并逐渐木质化；所述的MV液体培养基由以下成分构成：KNO₃80mg/L、Ca(NO3)₂·4H₂O150mg/L、KCl65mg/L、MgSO₄·7H₂O350mg/L、NaH₂PO₄·H₂O100mg/L、Na₂SO₄200mg/L、MnSO₄·H₂O22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L、CoCl₂·6H₂O0.025mg/L、CuSO₄·5H₂O0.025mg/L、H₃BO₃6.2mg/L、Na₂MO₄·2H₂O0.25mg/L、KI0.83mg/L、FeSO₄·7H₂O28.7mg/L、Na₂-EDTA37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡多醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2.0mg/L。