一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法

摘要

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，包括1）提取病毒RNA；2）RT-PCR扩增；3）套式PCR扩增；4）PCR产物的克隆及测序分析等步骤。扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的S部分基因，扩增片段长782bp(位于S基因的1316bp-2097bp)，并且包含位于S基因1495bp-1914bp之间的中和抗原表位，实现能扩增在vero细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的S基因，捕捉到了猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中S基因，特别是中和抗原表位的序列变化，从而能了解其与PEDV免疫效力变化的相关性。

主权项

一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于其包括以下步骤：1）提取病毒RNA：原病料经12000rpm离心5分钟后取上清液获得细胞培养液，‑20℃反复冻融2‑3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0提取病毒RNA；2）RT‑PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO:2，采用TaKaRa PrimeScript one step RT‑PCR Kit Ver.2进行扩增； 3）套式PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4，对步骤2中的RT‑PCR扩增产物采用TaKaRa Premix Taq Version 2.0扩增；4）PCR产物的克隆及测序分析：采用BIOMIGA Gel/PCR  Extraction Kit进行PCR产物的纯化；将纯化的PCR产物连接到pMD20‑T Vector载体上；连接产物转化DH5α感受态细胞；筛选阳性克隆并进行测序。2. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤1）采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0提取病毒RNA顺次按以下步骤进行：①取200µl冻融的细胞培养液放入1.5ml离心管中，加入200µl的Solution A，剧烈振荡混匀后，室温放置5分钟；②加入75µl的Solution B，混合均匀后，12000rpm离心5分钟；③将上清液转移到新的Collection Tube中，加250µl异丙醇，上下颠倒混匀；④将试剂盒中的Spin column安置于另一新的Collection Tube上，将③中的上清液转移至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液；⑤将500µl的Rinse A加入至Spin column中，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，弃滤液；⑥将800µl的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液；⑦再次进行12000rpm离心1分钟；⑧将Spin column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin column膜的中央处加入50µl的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置1分钟；⑨12000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA，提取的病毒RNA立即用于后续试验或‑20℃保存。3. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于：步骤2）中RT‑PCR反应体系为PrimeScript one step enzyme Mix                1µl2×1 step buffer                            12.5µl10µM SEQ ID NO:1                          2µl 10µM SEQ ID NO:2                          2µlRNA样品                                    3µlRNase Free dH2O                            4.5µl；    反应程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，53‑54℃退火30s，72℃延伸1min，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存。4. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于：步骤3）中套式PCR扩增反应体系为Premix Taq                        12.5µlRT‑PCR产物                       1.5µl10µM SEQ ID NO:3                  2µl 10µM SEQ ID NO:4                  2µl灭菌蒸馏水                          7µl；反应程序为94℃预变性2min；98℃变性10s，52‑55℃退火30s，72℃延伸50s，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存。5. 根据权利要求1‑4任一项所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤4）中，所述PCR产物的纯化具体步骤如下：①取100‑200µl的PCR产物，加入2倍体积的Buffer GC，混合均匀，瞬时离心，将溶液收集到底部；②将以上混合液加入带有收集管的吸附柱中，室温下，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中；重复步骤②，直至剩余的混合液全部通过吸附柱；③加入650µL DNA Wash Buffer至吸附柱下，室温下，13000rpm离心30秒，弃去流出液；重复步骤③；④室温下，13000rpm，将吸附柱开盖离心2分钟，去除残留的乙醇；⑤转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30‑50µl 60℃预热的Elution Buffer或灭菌蒸馏水到吸附柱膜中央，室温放置1分钟，13000rpm离心1分钟，洗脱DNA，将洗脱液加回到吸附柱中重新洗脱一次，洗脱的DNA立即用于后续试验或‑20℃保存。6. 根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤4）中，将纯化的PCR产物连接到pMD20‑T Vector载体上具体步骤如下：①在1.5ml离心管中配制下列溶液，全量为5µl；          pMD20‑T Vector            1µl          PCR纯化产物                     2µl           蒸馏水                           2µl②加入5µl的SolutionⅠ；③16℃反应30分钟；④洗脱的DNA与 pMD20‑T Vector的连接产物‑20℃保存。7. 根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤4）中，连接产物转化DH5α感受态细胞顺次按以下步骤进行：①取3µl连接产物放入100µl DH5α感受态细胞悬液中，轻轻混匀；②冰上放置20‑30分钟，然后42℃水浴热激90秒，迅速冰上冷却2分钟；③立即加入0.8mlLB液体培养基，摇匀后于37℃150‑180rpm振荡培养45‑60分钟；④取培养液200µl接种于含有100µg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀；⑤倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养14‑16小时。8. 根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤4）中，筛选阳性克隆并进行测序顺次按以下步骤进行：①挑取培养皿上的单个菌落，每个单菌落接种于2ml含100µg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃180‑200rpm振荡培养14‑16小时；②采用引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4，用TaKaRa Premix Taq Version 2.0 PCR鉴定阳性克隆，反应体系为：Premix Taq                        12.5µl菌液                                4µl10µM SEQ ID NO:3                  2µl 10µM SEQ ID NO:4                  2µl灭菌蒸馏水                        4.5µl；反应程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s，52‑55℃退火30s、72℃延伸50s，设置30个循环；72℃延伸7min；16℃保存；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，出现782bp大小的条带的为阳性克隆菌液，对阳性菌进行序列测定。