乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法

摘要

本发明公开了一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，包括(1)HBV全长基因组的抽提、PCR扩增和克隆构建；(2)重组过渡载体的构建；(3)重组过渡载体的酶切与去磷酸化；(4)复制型质粒的构建，所述重组过渡载体由三个连接片段同时定向连接，两个插入的HBV片段之间形成两个反向的BspQI酶切位点，使用SOC培养基进行HBV全长基因组克隆和复制型质粒的菌落培养扩增。本发明应用了新型的全长基因组克隆载体、改进了酶切方案以及采用了新型菌落培养基。具有方法简捷，高效稳定的优点，可对的HBV临床分离株全基因组进行全面综合的表型研究，具有重要的应用价值。

主权项

一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，包括步骤(1)HBV全长基因组的抽提、PCR扩增全长基因组和克隆构建；步骤(2)重组过渡载体的构建；步骤(3)重组过渡载体的酶切与去磷酸化；步骤(4)复制型质粒的构建，其特征在于：步骤(1)中所述PCR扩增全长基因组，在扩增引物中同时加入BspQI和XbaI两个酶切位点，引物如下：P1 FULL：CCGG TCTAGA GCTCTTC tttttcacctctgcctaatcaP2 FULL：CCGG TCTAGA GCTCTTC aaaaagttgcatggtgctgg；步骤(1)中PCR产物纯化后经末端加A，将全长基因组片段插入TOPOXLPCR载体；步骤(2)中所述重组过渡载体由三个连接片段同时定向连接，两个插入的HBV片段之间形成两个反向的BspQI酶切位点，使用SOC培养基进行HBV全长基因组克隆和复制型质粒的菌落培养扩增；所述三个连接片段为(1)以步骤(1)得到的HBV全长基因组克隆为模板，以P1FULL/P3为引物进行PCR扩增的产物，其包含HBV完整的EnhI、EnhII、复制和转录起始点在内的1000nt‑1820nt片段；(2)以步骤(1)得到的HBV全长基因组克隆为模板，以P2FULL/P5为引物进行PCR扩增的产物，其包含了HBV的POLYA序列的1820nt‑2000nt区域；(3)以EcoRI/PstI酶切后的pSP65载体；上述两段扩增的产物纯化后分别以EcoRI/XbaI和PstI/XbaI酶切，并以EcoRI/PstI酶切pSP65载体，三段酶切产物纯化后同时进行连接反应；步骤(2)中重组过渡载体引物如下：P3：CCGG GAATTC ACAGAGCTGAGGCGGTGTCGP5：CAGA CTGCAG GTCTTTTGGG(C/G)TTTGC(T/C)GCCCCP1 FULL：CCGG TCTAGA GCTCTTC tttttcacctctgcctaatcaP2 FULL：CCGG TCTAGA GCTCTTC aaaaagttgcatggtgctgg；步骤(3)中重组过渡载体的酶切使用BspQI内切酶；步骤(4)利用BspQI酶切步骤(1)构建的含有HBV全长基因组的重组载体，凝胶电泳后切取3.2kb条带，纯化后将HBV全长基因组连接入步骤(3)处理后的重组过渡载体。