一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法

摘要

本发明公开了一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法，包括如下步骤：(1)选择TK-11为特异性肽段进行β-乳球蛋白定量；(2)合成上述肽段，同位素标记肽段；(3)采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量；(4)样品处理及酶切；(5)液质分析：酶切处理后的溶液滤膜过滤后，滤液采用质谱进行选择性离子扫描分析；(6)根据公式计算完成奶粉中β-乳球蛋白含量的测定。本发明所述方法测定结果准确、合理。

主权项

一种测定奶粉中β‑乳球蛋白含量的方法，其特征在于：包括如下步骤： (1)选择TPEVDDEALEK，即TK‑11为特异性肽段进行β‑乳球蛋白定量； (2)合成上述肽段，同时使用同位素标记氨基酸合成对应的同位素标记肽段； (3)以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标准物质为标准，以同位素标记缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量； (4)样品处理及酶切：称取0.1g奶粉样品溶于0.8g的PBS‑T磷酸缓冲盐溶液中，在60℃下水浴加热15min，每2min摇晃一次样品溶液；水浴结束后，加入15.2g50mM的NH4HCO3溶液，混匀；将样品溶液在8437g离心力下离心20分钟，取出3g上清液，加入6g50mM的NH₄HCO₃溶液稀释三倍，取2.7g溶液进行超滤，超滤管截留分子量为3kDa，离心力为6500g，离心15分钟，加入1mL50mM的NH₄HCO₃溶液进行淋洗，离心力为6500g，离心15分钟，共淋洗5次，然后加入100μL浓度为0.095mg/g的同位素标记TK‑11溶液并称重，加入35μL0.1M的二硫苏糖醇溶液，在60℃水浴中加热15min，然后加入35μL0.1M的碘乙酰胺，在封闭抽屉里反应40min，加入105μL0.1M的DTT还原多余的IAA，加入5μL0.5mg/mL的Trypsin溶液在37℃进行酶切，酶切16小时后加入200μL0.1M HCl溶液终止酶切反应； (5)液质分析：酶切处理后的溶液用0.22μm滤膜过滤后，滤液采用液相色谱进行分离、采用质谱进行选择性离子扫描分析； (6)奶粉中β‑乳球蛋白含量的测定：根据质谱测定的TK‑11与同位素标记TK‑11的峰面积比及强度，配制相应比例非标记TK‑11与同位素标记TK‑11的混合标准液。根据单点法或括弧法计算酶解液中肽段TK‑11含量，根据公式四计算奶粉溶液中已被酶解的β‑乳球蛋白的含量，g/g，表示为c₃： 公式四：式中，m_TK‑11'为根据单点法或括弧法计算出的奶粉酶解液中TK‑11的质量，g；MW_TK‑11为TK‑11的分子量；MW_Pro为β‑乳球蛋白的分子量；m_S'为奶粉溶液的质量，g； 根据公式五计算出奶粉中β‑乳球蛋白的含量： 公式五：式中，c₃为根据公式四计算出的奶粉溶液中已被酶解的β‑乳球蛋白的含量，g/g；m_s'为奶粉溶液的质量，g；m为称取奶粉的质量g，E为酶切效率。