一种病毒通用PCR检测方法

摘要

本发明涉及病毒检测方法，具体涉及一种病毒通用的PCR检测方法。其包括样品处理、提取核酸、扩增处理、电泳观测、扩增产物克隆、基因组测序分析等步骤。本发明所述的病毒通用的PCR检测方法，避免宿主基因组、细菌或外源病毒感染，具有较好的特异性和重复性。本发明的方法用于快速鉴别诊断不同病毒，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性，并可用于生产中快速检测临床未知病毒感染样品和快速有效检测新病毒或基因变异大的病毒毒株。

主权项

一种病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：取植物组织样品100‑200mg在液氮中研磨至匀浆，匀浆液在液氮中或‑80℃温度下反复冻融三次，10000‑12000rpm离心10min，取上清为样品；还包括以下步骤；1） 样品处理将样品用0.2‑0.25um滤器过滤，滤液经30‑30K超滤管5000rpm离心20‑30分钟，浓缩至1‑2ml，余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液，合并后得到浓缩病毒液，浓缩病毒液中分别加入2‑5μl的DNase 2‑5μl的RNase及5‑10μl10× Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃5min终止消化；2）提取核酸消化好的病毒液，用总核酸试剂盒分别提取病毒DNA和RNA；3）扩增处理取病毒DNA或RNA提取液10μl，2ul 10μM的随机引物，加入到反应体系中，离心混匀后，进行PCR或RT‑PCR扩增处理；4）电泳观测：取上述扩增处理后的样品5‑10μl，用含有0.5‑1.0μg/ml溴化锭的0.8‑1%w/v琼脂糖凝胶，经过10‑20min电泳和显色，5）扩增产物克隆将电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收，回收产物连接于T载体，加入到连接体系中，于10‑16℃过夜连接；连接产物加入至50‑100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于40‑42℃水浴热激80‑90s，置冰上3～5min后，加入300‑500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h，将培养液于2000‑3000rpm离心3min，弃去培养基，剩余培养基重新与样品处理中过滤后沉淀混合，混合液涂布于AMP⁺ LB固体培基，充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h；取5‑10个克隆，分别于AMP+LB培养基培养3～6小时，试剂盒提取质粒后，于37℃对质粒进行双酶切1‑2h；6）基因组测序分析取上述双酶切后的样品5‑10μl，与2‑6μl 的0.25%w/v溴酚蓝上缓冲液混合，在含有0.5‑1.0μg/ml溴化锭的0.8‑1%w/v琼脂糖凝胶，经过10‑20min电泳和显色，在投射紫外灯下观察酶切结果阳性的样品进行测序。2. 根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述3）步骤中，取DNA提取液时，采用一次PCR扩增，即将10μl DNA提取液，2ul 10μM的随机引物，加入PCR反应体系中，ddH₂O补足50μl，离心混匀后，通过94‑95℃解链2min；然后94‑95℃变性30‑40s；退火复性30℃ 2min ，33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s， 再72℃延伸2min，经过30‑35个循环，最后72℃延伸5‑10min；4℃冷却保存10min，得到扩增样品。3. 根据权利要求2所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应体系成分为 2×PCR Master Mix 25μl。4. 根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述3）步骤中，取RNA提取液时，采用一次RT‑PCR扩增，即将10μl RNA提取液，2ul 10μM的随机引物，加入RT‑PCR反应体系中，RNase free dH₂O补足50μl，离心混匀后进行通过94‑95℃解链2min；然后94‑95℃变性30‑40s；退火复性30℃ 2min ；33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s，再 72℃延伸2min，经过30‑35个循环，最后72℃延伸5‑10min；4℃冷却保存10min，得到扩增样品。5. 根据权利要求4所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述RT‑PCR反应体系成分为 Prime Script1 step Enzyme Mix 2μl，2×1 step Buffer 25μl。6. 根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述随机引物的DNA碱基序列为VVVVVVVVAA，其中V为T、G、C中的任一种。