一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法

摘要

本发明涉及一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法，其利用此犊牛睾丸细胞系接种羊口疮病毒，达到病毒病毒能够稳定大量增殖的目的，为羊口疮病毒弱毒疫苗研制和生产提供了稳定的细胞环境和标准化的培养系统。本发明包括以下步骤：（1）犊牛睾丸细胞的获取、分离与培养；（2）犊牛睾丸细胞永久化的建立；（3）羊口疮病毒在细胞系的增殖培养。

主权项

1.一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）犊牛睾丸细胞的获取、分离与培养；（2）犊牛睾丸细胞永久化的建立；（3）羊口疮病毒在细胞系的增殖培养；步骤（1）中，犊牛睾丸细胞的获取为犊牛出生后未进食前采集犊牛的睾丸，低温运输，然后分离睾丸细胞；步骤（1）中犊牛睾丸细胞的分离为机械法或胰蛋白酶消化法；步骤（1）中犊牛睾丸细胞的培养液为M199、DMEM高糖或RPMI-1640培养基；步骤（2）中犊牛睾丸细胞永久化的建立是通过导入端粒酶逆转录基因方法实现的；步骤（2）中，在犊牛睾丸细胞永久化的建立过程中，利用脂质体2000进行真核表达载体细胞转染，并利用RT-PCR法检测稳定转染的犊牛睾丸细胞中hTERT的表达；所述的步骤（1）犊牛睾丸细胞的获取、分离与培养；无菌条件下，Hank’s液冲洗睾丸3次，无菌剪刀剪去附睾及白膜，留下睾丸实质，Hank’s液冲洗睾丸实质，直至无血液，然后将其移至无菌三角瓶内；用眼科剪将睾丸剪碎，约1~3mm大小，Hank’s液冲洗，静置2-3min；弃去上清，反复洗涤3次，加入PH7.6，0.25%的胰蛋白酶，用量为组织体积的2~4倍，4℃静置过夜；隔天后，吸去胰蛋白酶，加入M199培养液，轻轻吹打，将细胞吹散，50mL离心管离心，1000rpm，离心10min，弃去上清，加入培养液重悬细胞，调整细胞密度，37℃，5%CO₂培养；所述的步骤（2）犊牛睾丸细胞永久化的建立：培养的犊牛睾丸细胞铺满培养瓶的60%～70%时，利用脂质体2000进行真核表达载体pCI-neo-hTERT细胞转染，进行新霉素筛选培养，进行细胞扩大传代；提取第20、60代转染细胞和未转染的细胞的总RNA，逆转录反应合成cDNA，利用特异性引物扩增hTERT片段和内参GAPDH，检测hTERT的表达，hTERT引物：hup：5’GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG3’；hdown：5’CGACGTAGTCCATGTTCACAA3’，退火温度55℃；GAPDH引物：Gup：5’GAAGGTGAAGGTCGGAGT3’；Gdown：5’GAAGATGGTGATGGGATTTC3’，退火温度56℃；所述的步骤（3）羊口疮病毒在细胞系的增殖培养：取细胞系冻存细胞复苏后，用含10%犊牛血清的1640培养基悬浮细胞，37℃,5%CO₂培养48h，取300L～500L的羊口疮疫苗株病毒，接种细胞系，继续培养96h，观察病变；待培养细胞出现空斑时，冰冻整个培养物；然后反复冻融三次后，离心，收集上清，测定病毒滴度。