一种重组人朊蛋白hPrP及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种重组人朊蛋白hPrP及其制备方法和应用，该重组hPrP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明以人全血基因为模板，以SEQ ID No3、4所示核苷酸序列为引物通过PCR方法获得带有酶切位点的人朊蛋白DNA序列，将其连接到pPROEX-htb质粒上，通过定点突变技术除去表达载体中目的基因之前的多余酶切位点，获得hPrP全真表达载体。将该载体在大肠杆菌中表达、过高亲和力层析柱纯化、复性，得到了重组人朊蛋白。本发明所得到的重组人朊蛋白hPrP具有较好的生物活性，可用于开发人朊蛋白多克隆抗体、单克隆抗体以及针对人的朊病毒病诊断试剂盒。

主权项

一种制备重组人朊蛋白hPrP的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将重组表达载体转化入感受态细胞，制得人朊蛋白hPrP表达工程菌；其中所述重组表达载体为pPROEX‑htb‑hPrP，其含有重组人朊蛋白hPrP编码基因的表达盒，其中，重组人朊蛋白hPrP的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，其编码基因如序列表中SEQ ID No.1所示，所述重组表达载体pPROEX‑htb‑hPrP通过如下步骤构建得到：①PCR方法扩增hPrPc基因；该步骤中所用的引物，其序列分别为：上游引物：cgcGGATCCCAAGAAGCGCCCGAAGC，划线部分为保护碱基及BamH I酶切位点,下游引物：cccAAGCTTACGATCCTCTCTGGTAATAGGCC，划线部分为保护碱基及Hind III酶切位点；②将PCR产物和载体pPROEX‑htb分别用内切酶BamHI和Hind III双酶切；酶切产物连接后转化感受态细胞，挑取阳性菌落，得到前期表达质粒；③以前期表达质粒为模板，以除去hPrPc基因前的酶切位点为目的设计引物，进行PCR反应，所述引物序列为：P1：GAAAACCTGTATTTTCAGGGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGG，P2：CAGGCTTCGGGCGCTTCTTGCCCTGAAAATACAGGTTTTC；将PCR产物转化感受态细胞，选取阳性菌落提取质粒，得到重组表达载体pPROEX‑htb‑hPrP；2）将人朊蛋白hPrP表达工程菌经IPTG诱导表达；将表达产物过镍‑NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的人朊蛋白hPrP；其中，表达产物洗脱纯化的步骤为将诱导表达后的2L人朊蛋白hPrP表达工程菌液进行12000rpm15min离心，收集沉淀，在沉淀中加入200mL结合缓冲液，超声破碎一直到菌液变得澄清，0.45μmm滤膜过滤；100mL结合缓冲液利用重力作用通过10mL镍‑NTA琼脂糖树脂层析柱进行平衡，过滤后的菌液通过镍‑NTA琼脂糖树脂层析柱，用200mL结合缓冲液自然冲洗镍柱以去除杂蛋白，然后用200mL洗脱缓冲液进行洗脱，洗下的液体即为纯化好的人朊蛋白hPrP；所述结合缓冲液配方为8M尿素，20mMNa₃PO₄、500mM NaCl、pH8.0；所述洗脱缓冲液配方为8M尿素，20mMNa₃PO₄、500mM NaCl、pH8.0；3）将纯化的人朊蛋白hPrP复性后加入rTEV内切酶，切除组氨酸标签，然后再次通过镍‑NTA琼脂糖树脂层析柱除去组氨酸标签和重组rTEV酶，将洗脱收集的液体超滤浓缩，得到重组人朊蛋白hPrP。