一种以辣椒疫病为靶标的生防菌株高效筛选方法

摘要

本发明公开了一种以辣椒疫病为靶标的生防菌株高效筛选方法，将30克陶粒放入组培瓶中，加植物营养液40mL至刚好没过陶粒，将生防菌浸种处理过的催芽的辣椒种子定植在陶粒上，待辣椒长至四片真叶，在营养液面以下接种5mL调整浓度为10⁵mL^-1的游动孢子悬浮液。游动孢子悬浮液由辣椒疫霉菌在CA培养基上间歇光照处理6~8天后低温诱导得到。应用范围为以辣椒疫病为靶标的生防菌的筛选等。本发明的方法操作简单，从育苗到接种周期短，游动孢子接种便于实施和观察，在植物病害的生物防治研究工作中具有实际的指导意义。

主权项

一种以辣椒疫病为靶标的生防菌株高效筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行：(1) 种子消毒：将所需数目的辣椒种子用无菌水冲洗一遍，然后先后用75%的酒精和5%的NaClO分别处理30s和5min，选育辣椒品种为改良8819线椒；(2) 种子催芽：将消毒处理的种子于无菌水中浸泡4h，后放入铺有湿纱布的培养皿中，25℃的培养箱中避光48h催芽至露白；(3) 基质灭菌：将30克直径2~8 ㎜陶粒放入组培瓶中，陶粒高度为组培瓶高度的1/3，加植物营养液40mL，用封瓶膜封好；湿热灭菌，121℃，30min；  (4) 生防菌浸种：用挑针挑取拮抗细菌菌株的单菌落，转移至装有50 mL LB细菌培养液的三角瓶中，于37℃、150r·min^‑1震荡培养18 h制成含量为1.0×10⁸ cfu·mL^‑1拮抗菌液，将已催芽的种子浸入拮抗菌液浸种30 min；所述的LB细菌培养液指的是： 1升去离子水中加蛋白胨10克，酵母浸膏5克，NaCl 5克；(5) 定植：将已处理的种子用镊子均匀点入步骤（3）灭菌基质中，每瓶点8粒种子，封上封瓶膜，放入人工气候箱培养，人工气候箱参数设置为：温度为26℃，湿度为50%，光照16h，黑暗8h； (6) 植物营养液的添加：每周检查植物营养液的消耗情况，植物营养液的添加以不没过种子为宜；(7) 游动孢子制备：将辣椒疫霉菌接种在CA培养基上，间歇光照处理6~8天后，镜检孢子囊数量，当镜检视野中有大量孢子囊时，向培养皿中加10 mL无菌自来水，于4℃放置1h，随后室温光照1h诱导游动孢子释放，然后用消毒毛笔刷洗培养基表面，四层灭菌纱布过滤，收集游动孢子悬浮液，镜检游动孢子数量，调整接种浓度为10⁵ mL^‑1；所述的CA培养基指的是胡萝卜培养基，其配方为：将200克胡萝卜切片，加500 mL去离子水，匀浆机将胡萝卜片打碎，双层纱布过滤，加去离子水补至1升，加20克琼脂，每瓶100 mL分装，灭菌备用； (8) 病原菌接种：定植28天后待辣椒长出四片真叶，将移液枪头插入营养液面以下接种5 mL调整浓度为10⁵ mL^‑1的游动孢子悬浮液，接种后人工气候箱参数设置为：温度为28℃，湿度为70%，光照8h，黑暗16h，接种后第3、5天调查发病情况。