一种人胎盘屏障体外模型

摘要

本发明公开了一种新型人胎盘屏障体外模型，本模型模拟胎盘在母体内的环境，具备体内胎盘完整的绒毛结构，分泌功能和物质转运功能；本模型持续灌流5小时仍与在体胎盘保持了相似的功能活性，本模型的建立为研究胎盘的结构、功能、物质代谢及妊娠相关疾病提供了一种新的快速筛选方法，在毒理学、靶向治疗以及妊娠期应用药物的安全性评价领域具有广泛的应用价值。

主权项

一种胎盘屏障体外模型，其特征在于通过如下方法建立，包括步骤： 1)制备胎盘组织薄片 收集胎盘：选择25‑30岁，孕36‑40周足月分娩的健康产妇胎盘，胎盘娩出后，在无菌条件下，用冰冷的含4U/mL肝素的生理盐水充分冲洗胎盘，之后浸于冰冷的含4U/mL肝素的KRBB中备用； 切取胎盘组织块：在胎盘终末绒毛部位，取2块组织块，用KRBB漂洗； 玻璃化冷冻法冷冻胎盘组织：在室温下将组织块移至冷冻保护液A中平衡5min，然后移入冷冻保护液B中快速清洗至少10次，时间控制在50s内；之后迅速将组织块移至冷冻的叶片上，将载有组织块的冷冻叶片立即投入液氮中保存30s； 振动切片：按照Leica VT1000振动切片机的说明设置速度、频率、切片厚度，将冷冻好的胎盘组织块用专用胶水固定在切片机的托盘中进行切片； 组织复苏：将切好的胎盘组织薄片按照母体面‑胎儿面的方向固定于扩散池的夹片上，迅速浸入37℃含1.0mol/L的蔗糖液中1min，然后顺次移至含0.5mol/L、0.25mol/L的蔗糖液中，分别停留3min，最后在纯水中平衡5min； 2）建立人胎盘屏障体外系统 将恒温水浴槽经树脂胶管与温度加热块相连，调节恒温浴槽内水温维持Ussing扩散池内温度保持37℃恒温；将Ussing扩散池的通气针阀与气体供应装置连接，同时Ussing扩散池的两侧通入95％O₂和5％CO₂的混合气体；调节气体供应装置和扩散池的通气针阀控制通气流，以保证气泡缓慢均匀地从池底鼓出； 3）将胎盘组织薄片固定连接在扩散池中 样品固定：将复苏后的胎盘组织薄片固定于样品夹片上，将载有胎盘组织的样品夹片插入扩散池两室底部的插口内，固定完好； 加注灌流液：样品固定后即刻在扩散池的母体侧和胎儿侧同时缓慢加入预热至37.5℃，pH7.4的培养液KRBB7mL； 调节气流：调节气体供应装置和扩散池的通气针阀控制通气流，保证气泡缓慢均匀地从池底鼓出； 平衡：37.5℃恒温条件下维持胎盘组织薄片的活性，转运实验开始前将组织薄片预平衡30min； 所述冷冻保护液A是将7.5%乙二醇、7.5%DMSO、85%纯水充分混合后配制的溶液；冷 冻保护液B是将15%乙二醇、15%DMSO、70%纯水充分混合后配制的溶液； 所述KRBB是指通过下述方法制备的溶液：称取NaCl6.923g、KCl0.354g、MgSO₄·7H₂O0.288g、CaCl₂·6H₂O0.56g、NaHCO₃2.1g、Na₂HPO₄0.136g、葡萄糖1.8g、L‑丙氨酸0.178g，混合后以800mL双蒸水充分溶解，调节PH值至7.4，双蒸水补足体积至1000mL，过0.22μm滤膜，分装，4℃保存。