一种检测食品中呋喃它酮代谢物含量的方法

摘要

本发明公开了直接检测食品中呋喃它酮代谢物AMOZ含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。其特点是合成了三种不同的AMOZ半抗原衍生物，并将衍生物与载体蛋白质交联，合成三种免疫原和包被抗原，运用杂交瘤单抗制备技术制得单克隆抗体。所建立的ELISA可以无需衍生化步骤而直接检测样品中的AMOZ；所制备的单抗与其它硝基呋喃类物质及其代谢物和8种抗生素均没有交叉反应，说明抗体的特异性很高。四种肉样即鱼肉、虾肉、鸡肉和猪肝中加入不同量的AMOZ，并用ELISA直接测定，加标回收率为72.6-102.7％，相对标准偏差为6.1-17.7％；七份加标样品同时用HPLC和ELISA检测并比较测定结果，回归曲线为Y＝0.9742X-7.6001，线性相关系数为0.9889，表明两种方法有较好的相关性。

主权项

一种检测食品中呋喃它酮代谢物含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一：AMOZ修饰物的制备；步骤二：免疫原和包被抗原的制备；步骤三：AMOZ单克隆抗体的制备；步骤四：建立测定AMOZ的酶联免疫吸附分析方法；步骤五：ELISA对加标样品中AMOZ含量的测定；其中，所述步骤二包括：分别称取CPAMOZ I或CPAMOZ II，或CPAMOZ III和二环己基碳二亚胺，N‑羟基琥珀酰亚胺，一同溶解于二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜，将混合液离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入到0.01～0.02％的牛血清白蛋白即BSA和0.01～0.02％卵清白蛋白即OVA，搅拌1～10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，其中，CPAMOZ I‑BSA、CPAMOZ II‑BSA和CPAMOZ III‑BSA为免疫原；CPAMOZ I‑OVA、CPAMOZ II‑OVA和CPAMOZ III‑OVA为包被抗原；其中，所述步骤四包括：(1)溶液配制；(2)间接竞争ELISA步骤；(3)ELISA的优化条件和灵敏度；(4)ELISA的标准曲线；(5)ELISA的特异性；其中，所述(1)溶液配制包括：(a).碳酸钠‑碳酸氢钠缓冲液；(b).磷酸缓冲液；(c).酪蛋白溶液；(d).磷酸缓冲液‑吐温储备液；(e).底物溶液；(f).H₂SO₄溶液；(g)RPMI‑1640培养液；其中，所述(2)间接竞争ELISA步骤包括；(a).加入包被抗原于酶标板中，每孔200μL，冰箱4℃过夜；(b).用PBST缓冲液，PBST储备液，1∶10稀释，350μL/孔，洗板三次；(c).加入酪蛋白进行封阻，每孔300μL，室温保温保湿放置1小时；(d).用PBST缓冲液洗板三次；(e).在酶标板的每孔中依次分别加入100μL标准溶液和100μL一定稀释度的单克隆抗体，室温保温保湿放置1小时；(f).用PBST缓冲液洗板三次；(g).加入酶标二抗：羊抗鼠IgG‑辣根过氧化物酶(GaMIgG‑HRP)，每孔200μL，室温保温保湿放置1小时；(h).用PBST缓冲液洗板三次；(i).加入底物溶液，每孔200μL，室温保温保湿避光反应，在微量振荡器上振摇15～25分钟；(j).加入5％H₂SO₄溶液，每孔50～100μL，终止酶反应；(k).用酶标仪测定吸光度，作出标准曲线，进行结果分析与讨论；其中，所述(3)ELISA的优化条件和灵敏度包括：包被浓度为25ng/mL；细胞上清液稀释度为1∶1500；GaMIgG‑HRP为1∶10,000；封阻液为1％casein；孵育时间为1h；显色时间为15min；其中，CPAMOZ I的结构式为：CPAMOZ II的结构式为：CPAMOZ III的结构式为：