活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用

摘要

本发明公开了一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用。充分利用梯度反复冻融法的优势，改良“CTAB+冻融+溶菌酶+蛋白酶法”DNA提取法，并应用到高盐度采油废水生物处理系统的活性污泥DNA的高效提取中。主要利用CTAB对传统DNA提取缓冲液进行改良，利用梯度冷冻并溶出的方法有效分离所需DNA片段，再应用溶菌酶和蛋白酶法完成高盐度采油废水净化系统中活性污泥的DNA高效提取。该方法具有分离纯化程度高，运行操作过程简单且稳定，避免了高盐度含油废水对提取过程的影响，同时，实践表明该方法对高盐度含油背景下污泥中多种不可预知杂质均有良好的分离功能。

主权项

一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法，其特征在于具体步骤为：(1)均匀取得目标DNA来源体污泥20~30mL，其含水率大于98%，置于100mL离心管中，以6000~8000r/min的转速进行离心预处理5~8min，弃去上清液，过快速滤纸收集沉淀物质待用，所收集的沉淀物质小于1mL；(2)将步骤(1)所收集的沉淀物质加入到2mL的具塞离心管中，并加入1~2mL的DNA提取缓冲液，漩涡振荡器振荡5~10min后待用；所述DNA提取缓冲液含有100~150mmol/L的EDTA、100~150mmol/L的Tris‑HCl、1.5~3.0mol/L的NaCl、质量百分比浓度为2~5% 的CTAB和质量百分比浓度为1~3% 的PVPP，并使用0.1~0.5mol/L的HCl和NaOH稀溶液调节DNA提取缓冲液的pH值至8.0；(3)将步骤(1)制得的物质放入‑80℃冰箱中冷冻6~8min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，再放入‑60℃超低温冰箱冷冻10~15min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，接着放入‑40℃超低温冰箱冷冻25~30min，然后放入65℃水浴锅中水浴10min；每次冷冻后的水浴期间均要求颠倒混匀1~2次，完成梯度升温冷冻‑水浴解冻而制得样品备用；(4)向步骤(3)制得的样品中加入80~100μL浓度为10mg/mL的溶菌酶，置于37℃水浴中培养10~15min，每隔2~3min上下颠倒混匀一次，然后加入10~15μL浓度为10mg/mL蛋白酶K和150~200 μL 质量百分比浓度为10%的SDS，65℃水浴10min，然后直接放入‑80℃冰箱中速冻6~8min，最后在65℃温水中解冻28~32min；重复本冻融步骤3次，制得样品备用；(5)将步骤(4)制得的样品在常温下以6000~8000r/min的转速离心10~15min，取上清液分装于2mL的离心管中，加入等体积的体积比为1:1的Tris饱和酚‑氯仿混合液，上下颠倒混匀，在8000~10000r/min的转速下离心10~15min，即完成抽提，本抽提步骤重复2次，制得上清液备用；(6)将步骤(5)制得的上清液转移到1~2mL的离心管中，加入为上清液0.6~0.8倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置1~1.5h，在10000‑120000r/min的转速下离心10~15min，弃掉上清液，用预冷的50~70%的乙醇洗涤沉淀2~3次，在8000~10000r/min的转速下离心2~5min，用无水乙醇连续漂洗2次，弃上清液后，室温下风干，加入30μL无菌水即制得目标样品，目标样品在‑20℃下保存。