一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法

摘要

本发明提出了一种提取纯化TthDNA聚合酶的方法。包括如下步骤：取TthDNA聚合酶工程菌进行活化和IPTG诱导表达；用溶菌酶室温处理后加入DTT，吐温-20，冰上处理一段时间，离心得到粗蛋白；粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀；上清液补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤，最后用洗脱液洗脱目的蛋白，接收含目的蛋白的洗脱液；脱盐后即得到纯化的TthDNA聚合酶；得到的TthDNA聚合酶加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存。本发明的方法简单，酶活性损失小，回收蛋白的纯度和回收量高。

主权项

一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其步骤为，1）工程菌的活化和表达：取Tth DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，振荡培养后加入IPTG诱导培养8小时；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，离心；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；2）粗蛋白制备：将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT，再加入吐温‑20，冰上处理一段时间，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即为粗蛋白；3）粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀；4）上清液补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni‑NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液平衡；所述结合缓冲液为20mM Tris‑HCL，0.5MNaCl,PH8.0，5mM咪唑；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤，所述洗涤缓冲液为20mM Tris‑HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/50mM咪唑；最后用洗脱液洗脱目的蛋白，所述洗脱液为20mM Tris‑HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑，接收含目的蛋白的洗脱液；含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液为缓冲液B： 10mM Tris‑HCl ，pH 7.5 ，25°C， 300mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA；脱盐后即得到纯化的Tth DNA聚合酶；任选的，得到的Tth DNA聚合酶加入甘油使体积分数为50%，‑20℃保存。