一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的方法

摘要

本发明涉及一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的方法，是用乙二醛在半抗原分子GTX_2,3第2号和8号位亚氨位上引进2个自由的氨基，再用2步法将此中间产物(H₂N-GTX2,3)分别与载体蛋白BSA和KLH偶联，中间产物和偶联产物分别经超滤纯化后,经全波段紫外扫描和HPLC鉴定，鉴定结果表明本研究成功地制备了膝沟藻-麻痹性贝类毒素GTX2,3人工抗原，同时其具备较强的免疫原性；该方法能够有效地制备出膝沟藻毒素GTX_2,3人工抗原，从而生产出识别膝沟藻毒素GTX_2,3的抗体，这对于采用免疫分析技术快速检测膝沟藻毒素GTX_2,3具有重要的实际意义；整个制备过程简便可行，无需特别的仪器设备，成本低廉，容易规模化生产和推广应用；本方法合成的膝沟藻毒素GTX_2,3人工抗原具有较好的稳定性。

主权项

一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的方法，其特征在于：该方法是利用膝沟藻毒素GTX_2,3与载体蛋白BSA及KLH大分子偶联制备人工抗原的方法，用乙二醛在半抗原分子GTX_2,3第2号和8号位亚氨位上引进2个自由的氨基，再用2步法将此中间产物H₂N‑ GTX2,3分别与载体蛋白BSA 和KLH 偶联.具体方法如下：(1)  均取85μL 的2.37mg.mL^‑1 GTX2,3毒素原液在避光下加入少量0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，轻弹混匀，使得溶液的pH值为4.6；(2) 向(1)溶液中分别加入适量新鲜配制的乙二醛， 使醛的终浓度为0.1～3%；(3) 称取0.0023 g BSA、0.0023 g KLH 分别溶于160 μL 0.01 mol·L^‑1 pH7.6的PBS 中， 分别加入上述（2）溶液中；使GTX：BSA的摩尔比为3～20，GTX：KLH的摩尔比为5～25；(4) 25℃反应20～80h后转入4℃冰箱反应10～30 h，即先将GTX2,3活化；(5) 将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的超滤管，并记下溶液的体积，3000～8000rpm离心5～20min；或者将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的透析袋中，4℃透析过夜；(6) 收集超滤外液，并向超滤管中加入适当体积的0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，使得溶液的pH值为4.6，重复离心2～3次，超滤离心除去未反应的毒素、醛类小分子；(7) 超滤3 次后取超滤外液0.5 mL 注射小鼠，5 min 后小鼠死亡；(8) 继续超滤离心：重复超滤离心5 次后，取超滤截留物及超滤外液分别注射小鼠，未见死亡；(9) 将超滤管倒转离心，3000～8000rpm离心5min，收集管内容物，分装， 20℃保存，得到GTX2,3‑BSA和GTX2,3‑KLH；(10)得到的产物用MiliiPore 超滤装置过滤后，冷冻干燥即得到的蛋白质抗原；所述的GTX_2,3先与终浓度为0.1～3%的乙二醛结合，再与载体蛋白BSA和KLH偶联；所述膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白的摩尔质量比为1∶3～25。