一种A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及其制备方法与应用，它是以T-2毒素作为前体，进行结构修饰，制备具有A型单端孢霉烯族毒素母核结构免疫反应性的族半抗原3-Ac-NEOS，并通过与大分子蛋白BSA和OVA的偶联，将只有免疫反应性的小分子半抗原转化为具有免疫原性的完全抗原，免疫动物，制备的抗血清效价较高，满足免疫学检测对抗体的要求。以该抗体为基础，建立的免疫学检测技术，操作简便，特异性强，灵敏度高，可广泛应用于食品、饲料及动物机体内A型单端孢霉烯族毒素（包括隐蔽态A型单端孢霉烯族毒素）的检测。如以该抗体制备的ELISA试剂盒可用于检测对虾体内的隐蔽态T-2毒素。

主权项

一种A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体，其特征在于：以族半抗原3‑Ac‑NEOS为基础，与载体蛋白BSA和OVA相连接合成人工免疫原和包被原，其中人工免疫原再经过动物免疫，取血，分出抗全血清，纯化制得抗体；族半抗原3‑Ac‑NEOS结构式为：以族半抗原3‑Ac‑NEOS为基础，与载体蛋白BSA相连接，合成分子式为：     以族半抗原3‑Ac‑NEOS为基础，与载体蛋白OVA相连接，合成分子式为：      一种A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体的制备方法，其特征在于：由下述步骤制得：（1）半抗原的设计与合成：为制备A型单端孢霉烯族毒素多克隆抗体及包被原，合成A型单端孢霉烯族毒素的族半抗原3‑Ac‑NEOS；3‑Ac‑NEOS的合成：    1）以T‑2毒素作为反应底物，加入无水吡啶和醋酸酐，对T‑2毒素C3位羟基进行乙酰化，制备得3‑乙酰基‑T‑2，对反应产物进行硅胶过柱纯化，以正己烷/乙酸乙酯50：50作为洗脱剂，进行质谱分析；质谱分析：检测所得的最强离子峰的m/z为526.66[M+18]⁺，得分子量为508与目标产物3‑Ac‑T‑2毒素的理论分子量相符；2）利用大鼠的红细胞酶解液酶解处理3‑乙酰基‑T‑2，制备得3‑Ac‑NEOS，对所得产物，先进行大孔树脂过柱纯化，后再经硅镁吸附剂柱进行纯化，分别以丙酮和氯仿作为洗脱液，纯化后对产物进行浓缩结晶，并进行结构鉴定： 结构分析：一级质谱检测最强峰442.45[M+18]+符合已知3‑Ac‑NEOS的理论分子量MW=424；二级质谱，显示了特征子离子峰305.03；1H‑NMR在2.024，2.182和2.246分别具有较强的峰，为目标产物3‑Ac‑NEOS三个乙酰基特征峰，并且在4.122出现峰，为C8位羟基所产生；（2）人工抗原的合成用琥珀酸酐法在半抗原3‑Ac‑NEOS的C8位羟基上构建酰胺基连接臂，并通过碳二亚胺法，分别连接到牛血清白蛋白和卵清蛋白上，合成人工免疫原和人工包被原，具体做法如下：通过琥珀酸酐法在制备的族半抗原C8位引入连接臂，将4 mg 3‑Ac‑NEOS与80 mg琥珀酸酐混合溶于2 mL吡啶中，蒸气浴下反应4 h，间歇性加入丙酮，后溶液呈淡黄，后将反应混合物用氮气吹干，复溶于4 mL氯仿中，蒸馏水水洗四次，对抽提物进行浓缩干燥，制备得3‑Ac‑NEOS‑HS； 3‑Ac‑NEOS‑HS‑BSA制备：将2 mg 3‑Ac‑NEOS‑HS用0. 2 mL二甲基甲酰胺DMF溶解，制得A液；5 mg BSA、3 mg EDC加25 mL蒸馏水溶解，制得B液；将A液逐滴加入B液中，边加边搅拌；10 min后，加1 mg EDC，室温、pH 5. 5条件下继续搅拌18 h，后用PBS溶液透析3 d，每天换液一次，透析完成后，分装冷冻干燥，包被原3‑Ac‑NEOS‑HS‑OVA制备同上；（3）免疫和特异性抗体制备：1）免疫：免疫动物选用新西兰种雌性大白兔，免疫方法采用皮下注射，初次免疫后，间隔两周进行加强免疫，在每次加强免疫后的第10天在兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测；初次免疫：取溶有400 µg族完全抗原3‑Ac‑NEOS‑HS‑BSA的0.9% NaCl溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；加强免疫：取溶有200 µg族完全抗原3‑Ac‑NEOS‑HS‑BSA的0.9% NaCl溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化完全后，进行动物免疫；2）抗体纯化：定时检测动物抗体效价，当抗体对一定的包被原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，利用硫酸铵沉淀法纯化抗血清，制备得目标多克隆抗体。