重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备

摘要

本发明提供一种重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备，重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因上有下列六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点，不影响VP6蛋白原有的分子结构，保留了VP6蛋白原有所有抗原表位，并都位于蛋白分子的表面，可最大限度的展示外源抗原表位免疫学性质，以便将其他病毒的抗原表位插入本发明的重组轮状病毒VP6载体蛋白中，从而构建出轮状病毒RV与其他病毒联合重组的嵌合疫苗及试剂。

主权项

一种重组轮状病毒VP6载体蛋白的构建方法，其特征在于通过下列步骤：1）根据轮状病毒TB‑Chen株VP6蛋白基因的核苷酸序列，人工设计下列引物对：P174F：CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG；P174R：CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA；P197F：GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT；P197R：TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC；P244F：GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA；P244R；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；P275F：GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；P275R：AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；P298F：AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA；P298R：GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA；P308F：GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA；P308R：ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG；以及下列引物：PETL5：ATCATATGGAGGTTCTGTACTC；PVP6‑3：TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT；2）以轮状病毒TB‑Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增：PETL5/P174R和P174F/PVP6‑3；PETL5/P197R和P197F/PVP6‑3；PETL5/P244R和P244F/PVP6‑3；PETL5/P275R和P275F/PVP6‑3；PETL5/P298R和P298F/PVP6‑3；PETL5/P308R和P308F/PVP6‑3；PCR扩增反应体系为：PCR反应混合液体积为100μl，其中，分别含有60pmol的上述各引物对，以及30ng模板DNA，1×10⁵ pmol的dNTPs，10μl的 10× PCR缓冲液，5U Taq DNA聚合酶，其余用水补足；PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性40s，56℃复性30s，72℃延伸反应1min，共40个循环，最后72℃延伸10 min；分别得到：带有Sac I位点序列的PCR扩增片段：6174F和6174R；带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段：6197F和6197R；带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段：6244F和6624R；带有Bln I位点序列的PCR扩增片段：6275F和6275R；带有Sac II位点序列的PCR扩增片段：6298F和6298R；带有Xho I位点序列的PCR扩增片段：6308F和6308R；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化上述六对扩增片段；3）将步骤2）所得下列各扩增片段，按常规分别用下列对应的内切酶即内切酶I/内切酶II进行双酶切：带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F：Nde I/Sac I；带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174R：Sac I/BamH I；带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197F：Nde I/BspT104 I；带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197R：BspT104 I/BamH I；带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6244F：Nde I/Kpn I；带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6624R：Kpn I/BamH I；带有Bln I位点序列的PCR扩增片段6275F：Nde I/Bln I；带有Bln I位点序列的PCR扩增片段6275R：Bln I/BamH I；带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298F：Nde I/Sac II；带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298R：Sac II/BamH I；带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308F：Nde I/Xho I；带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308R：Xho I/BamH I；酶切反应体系为：分别含有3μl 的上述各基因片段，以及3μl的15U内切酶I ，3μl的15U内切酶II，和8μl的10×缓冲液及63μl的水；将各酶切混合液分别于37℃水浴反应3小时后，得对应的六个酶切片段，分别用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化六个酶切片段；4）将步骤3）所得六个酶切片段对分别与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，最终在同一个VP6蛋白上构建出携带有Sac I（gagctc），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag）六个酶切位点的VP6载体蛋白编码基因；5）、将步骤4）得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到pET表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒：pET6F；6）按常规将步骤5）所得重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定，之后将重组质粒pET6F在下列条件下分别转化BL21（DE3）感受态细胞：10μl 重组质粒pET6F与100μl的 BL21（DE3）感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42℃放置70秒钟，加入500μl的LB培养液后，在37℃培养30分钟；培养物涂在含200μg/ml氨苄青霉素的1.5%琼脂培养板上，将培养板于37℃培养14个小时，挑取单个菌落放入含200μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，得携带有Sac I（gagctc），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag）六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F。