液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法

摘要

本发明涉及一种菌粉，提供一种液体发酵产生冬虫夏草菌粉的方法。1）斜面菌种培养；2）大米孢子培养；3）发酵培养，包括一级种子罐培养和二级发酵培养；4）制备菌粉。能够减少种子扩级次数，发酵周期约为120～160h，能有效缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，提高产能，节约生产成本，最终菌体产率达到4%～6%，菌体干重达到40～60g/L，能达到工业化生产的要求。

主权项

液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于包括如下步骤： 1）斜面菌种培养；所述斜面菌种培养的具体方法如下：配制斜面培养基，所述斜面培养基的组分为：葡萄糖15～35g/L、蛋白胨0.5～4g/L、MgSO₄·7H₂O1～5g/L、KH₂PO₄0.5～1g/L、土豆浸汁150～250mL/L、辅液Ⅰ1～4mL/L、琼脂20～25g/L、其余为水，pH5.9～6.6，以上各组分除辅液Ⅰ外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅰ于118℃单独灭菌22min后加入无菌培养基，接种环粘少量无菌水，把冬虫夏草菌种从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，待斜面长满新鲜成熟孢子即可；所述冬虫夏草菌种为冬虫夏草（Cordycepes sinensis（Berk.）Sacc），购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC50562；所述辅液Ⅰ组分为：盐酸硫胺1～4g/L、核黄素1～4g/L、维生素B3 0.5～1g/L、盐酸吡哆素0.6～1.2g/L、甘氨酸0.8～1.4g/L、生物素0.08～1.2g/L、赤霉素0.02～0.04g/L、NaSeO₃ 0.001～0.004g/L，其余为水； 2）大米孢子培养；所述大米孢子培养的具体方法如下：配制固料培养基，由固料以及营养液组成，其中固料∶营养液=1g∶（0.5～0.7）mL，固料由大米和麸皮组成，其中大米∶麸皮按质量比为7∶3，营养液组分除去琼脂以外与斜面培养基的组分相同，固料与营养液混匀后75～80℃蒸或煮，冷却至室温后将成团的大米弄散，装入K瓶，121℃灭菌30～40min，灭菌完后充分抖散，使固料培养基厚度保持在1～4cm，向长满孢子的斜面加入无菌生理盐水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在1.0～2.5×10⁶个/mL，按固料质量体积比的3%～6%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，抖动均匀后保持厚度在1～4cm，培养条件为湿度控制45%～55%，温度控制15～18℃，每隔6h翻抖一次固料，待长出菌丝体后静止培养，长满孢子后加入无菌生理盐水震荡制成孢子悬液，其中每粒亲米孢子数量为0.02～0.04×10⁹个/粒，按照体积比为1%～5%接入一级种子罐培养； 3）发酵培养，包括一级种子罐培养和二级发酵培养； 所述一级种子罐培养的具体方法如下：配制一级种子培养基，其组分为：土豆浸汁200～300mL/L、葡萄糖10～30g/L、蔗糖10～30g/L、酵母浸膏5～20g/L、蛋白胨5～20g/L、KH₂PO₄ 1.5～4g/L、MnSO₄ 0.03～0.06g/L、NaCl 5～20g/L、氯化铵0.2～0.6g/L、氯化钙0.01～0.06g/L、辅液Ⅱ1～4mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅱ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅱ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到一级种子罐中，其中辅液Ⅱ的组分为：盐酸硫胺0.1～0.4g/L、核黄素0.5～2g/L、维生素B3 0.5～2g/L、盐酸吡哆素0.3～0.6g/L、甘氨酸0.8～1.6g/L、生物素0.04～0.08g/L、赤霉素0.02～0.06g/L、NaSeO₃ 0.002～0.006g/L，其余为水；把步骤2）培养好的孢子接入一级种子罐，培养条件为pH维持在5.9～6.6、温度18～20℃、罐压0.03～0.05MPa、通气比V∶V=1∶（0.5～0.8）、转速为130～ 170r/min、连续培养50～70h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可移入二级发酵罐； 所述二级发酵培养的具体方法如下：配制二级发酵培养基，其组分为：土豆浸汁200～300mL/L、葡萄糖10～30g/L、蔗糖10～30g/L、酵母浸膏0.5～2g/L、蛋白胨1～4g/L、KH₂PO₄ 0.5～4g/L、MnSO₄ 0.03～0.08g/L、NaCl 5～30g/L、氯化铵2～8g/L、氯化钙0.05～0.3g/L、辅液Ⅲ20～40mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅲ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅲ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到二级种子罐中，其中辅液Ⅲ组分为：维生素B1 0.02～0.08g/L、维生素B2 0.01～0.06g/L、维生素B6 0.03～0.09g/L、烟酰胺0.5～1g/L、甘氨酸0.4～1g/L、生物素0.004～0.008g/L、赤霉素0.01～0.04g/L，其余为水，将一级种子发酵罐培养好的菌丝按体积百分比20%～30%的接种量移入二级发酵罐，培养条件为：pH维持在5.9～6.6、温度18～20℃、罐压0.03～0.05MPa、通气比V∶V=1∶（0.6～0.9）、转速130～150r/min，在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比为1%～5%的全料和0.5%～2%的葡萄糖，其中全料的组分为：酵母浸膏2～6g/L、蛋白胨2～12g/L、KH₂PO₄ 3～10g/L、MnSO₄ 0.2～0.4g/L、NaCl 2～5g/L、氯化铵6～15g/L、氯化钙0.2～0.4g/L，辅液Ⅲ20～40mL/L，于121℃灭菌40min，葡萄糖浓度为24～48g/L，于118℃灭菌22min； 连续发酵至70～90h，待残糖＜0.5%～1%，氨态氮＜0.05%～0.1%，镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐； 4）制备菌粉。