一种GAI mRNA分子在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法

摘要

本发明公开了杜梨和‘鸭梨’GAI蛋白的氨基酸序列和编码该蛋白的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO1～4所示。本发明同时公开了GAI mRNA在杜梨和梨砧穗间传递的分子鉴定方法，包括如下步骤：1)‘鸭梨’为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接；2)寻找‘鸭梨’和杜梨的GAI基因各自特异的酶切位点，在此酶切位点的上下游分别设计引物；3)限制性酶切杜梨、‘鸭梨’以及嫁接后的杜梨、‘鸭梨’的RT-PCR产物，比较嫁接前后的酶切谱图鉴定传递情况。本发明提供的方法快速、灵敏，准确性高，简便，能够应用于其他梨属植物。

主权项

一种GAI mRNA分子在杜梨和鸭梨砧穗间传递的分子鉴定方法，包括如下步骤： （1）根据拟南芥、南瓜、苹果中GAI基因保守区设计引物，分离和克隆杜梨(Pyrus betulaefolia)、鸭梨(Pyrus bretschneideri)中编码DELLA蛋白的GAI基因全长，利用生物信息学方法进行序列分析，并对所得基因进行了比对及分析，证实所得基因属于GRAS家族； （2）‘鸭梨’为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接； （3）分析杜梨GAI基因和鸭梨GAI基因基因的核苷酸序列，所述杜梨GAI基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述鸭梨GAI基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，选择各自特异的酶切位点，在此酶切位点的上下游分别设计引物； （4）分别提取杜梨、鸭梨以及嫁接后砧木与接穗的总RNA，反转录成cDNA，PCR扩增GAI的基因片段； （5）用所选的限制性内切酶对PCR产物进行酶切，比较嫁接前后的酶切谱图，如果在嫁接体系中存在RNA的传递，则在砧木杜梨的扩增产物酶切后会出现接穗鸭梨特异性的条带，同样在接穗鸭梨的扩增产物酶切后也会出现砧木杜梨特异性的条带；如果不发生传递，那么扩增产物的酶切电泳图中就会显示出各自相应样品的条带而无其他杂带； 所述步骤（1）中的引物为：TTGATTTCCGAGCCCTACCC和AACTCGGTCATCGCTCACTGA； 所述限制性内切酶为HapⅡ。