一种低分子量肝素的制备方法

摘要

本发明提供了一种利用非哺乳类鱼类资源制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为：从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素，得到低分子量肝素冻干纯品，采用咔唑比色法计算含量，使用高效液相质谱联用仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析分子量和纯度，并通过羊血浆法测定抗Ⅱa效价和生色底物法测定抗Ⅹa效价对其活性进行评价。本发明利用非哺乳类鱼类资源，克服了由于哺乳动物不同种属之间存在的属间交叉病毒和朊病毒感染所带来的不利影响，并改进酶提取方法最终获得高凝血酶活性低分子量肝素。

主权项

一种制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为：从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素(UFH)，得到低分子量肝素冻干纯品，分析其分子量，并对其含量和活性进行测定；    其中，所述从鱼类组织中粗提获取未分级肝素组分的步骤为：在组织搅拌机中加入等量的鱼类组织和PBS缓冲液进行组织匀浆，将匀浆物中加入40％的NaOH调节pH到9.0，升温至80℃温育3小时，并以10000rpm离心，收集上清液备用；在上清液中加入50％硫酸铵进行盐析步骤，升温至80℃，搅拌1小时，8000 rpm离心，收集上清施加至强碱性阴离子交换树脂，并使用含有4M NaCl的PBS缓冲液对肝素进行洗脱；收集洗脱组分，使用截留分子量为1000Da的过滤器对洗脱液进行浓缩和脱盐，加入95％乙醇洗涤2‑3次后进行真空冻干处理，即获得未分级肝素冻干品；所述用肝素酶降解未分级肝素获得低分子量肝素的步骤包括：取UFH组分溶于pH7.4的PBS溶液中，充分溶解后离心去除杂质，在上清液中加入肝素酶III EC 4.2.2.8，37℃水浴反应10小时后，不加入相同量的肝素酶III，继续反应10小时，然后水浴升温加热至80℃，1小时候停止反应并10000rpm离心，收集上清液用0.22μm滤膜过滤，加入NaCl固体使其盐浓度为20％ wt，然后加入90％乙醇，低温静置过夜，直至有沉淀析出，8000 rpm离心 20min后，弃去上清收集沉淀，重复上述盐析、脱水步骤，将获得的沉淀冻干处理后即得低分子量肝素纯品。