一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法

摘要

一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，它涉及一种细胞内嘌呤碱基的检测方法。本发明要解决采用现有技术无法获得细胞内核苷酸代谢过程中嘌呤单质含量的问题。本发明方法：一、绘制标准曲线：通过电化学检测仪得到电化学信号计算峰面积，绘制每个标准品标准曲线；二、裂解液的二次电化学检测：待检测细胞的裂解液经第一次电化学检测，得到黄嘌呤-鸟嘌呤混合信号峰和腺嘌呤-次黄嘌呤混合信号峰；加入黄嘌呤氧化酶溶液后经第二次电化学检测，得到鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰；三、计算单嘌呤的含量：用加黄嘌呤氧化酶前得到的峰面积减去加黄嘌呤氧化酶后得到的峰面积，结合标准曲线，求出每种嘌呤碱基的含量。本发明用于细胞检测领域。

主权项

一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，按下述步骤实现：一、标准曲线的绘制将标准品配置成浓度为5×10^‑6mol/L～15×10^‑6mol/L的溶液，得到标准品溶液，使用电化学检测仪检测标准品溶液的电化学信号峰，经分析得到标准品的峰面积，绘制标准品标准曲线；步骤一中所述的标准品为鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤或黄嘌呤氧化酶；步骤一中所述的标准曲线以标准品的电化学信号峰面积为纵坐标，标准品的浓度为横坐标；二、裂解液的二次电化学检测①、向含有3×10⁵个/皿～5×10⁵个/皿待检测细胞的60mm培养皿中加入500μL的PBS缓冲溶液，然后在温度为45℃～55℃的条件下裂解25min～40min，得到裂解液B，将得到的裂解液B使用电化学检测仪进行第一次电化学检测，得到待检测细胞中黄嘌呤‑鸟嘌呤的混合信号峰和腺嘌呤‑次黄嘌呤的混合信号峰；步骤二①中所述的PBS缓冲溶液是将17.5g～17.9g的Na₂HPO₄·12H₂O和6.5g～6.8g的KH₂PO₄溶解到250mL的双蒸水中，混合均匀后得到的溶液，所述的PBS缓冲溶液pH值为7.0～7.4；②、向裂解液B中加入1μL～5μL浓度为0.35U/mL～0.45U/mL黄嘌呤氧化酶标准品溶液，然后在温度为20℃～30℃的条件下孵育40min～48min，得到经酶催化反应后裂解液C，将得到的裂解液C使用电化学检测仪进行第二次电化学检测，得到待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰；三、计算单嘌呤的含量根据步骤二①得到的待检测细胞中黄嘌呤‑鸟嘌呤的混合信号峰和腺嘌呤‑次黄嘌呤的混合信号峰以及步骤二②得到的待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰，经分析得出黄嘌呤‑鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积、腺嘌呤‑次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积、鸟嘌呤信号峰的峰面积和腺嘌呤信号峰的峰面积；将得到的黄嘌呤‑鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积与鸟嘌呤信号峰的峰面积做差得到黄嘌呤信号峰的峰面积；将得到的腺嘌呤‑次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积与腺嘌呤信号峰的峰面积做差得到次黄嘌呤信号峰的峰面积；由得到的单嘌呤的峰面积，再结合步骤一得到的鸟嘌呤标准品标准曲线、次黄嘌呤标准品标准曲线、腺嘌呤标准品标准曲线或黄嘌呤标准品标准曲线，得到裂解液B中次黄嘌呤的浓度、黄嘌呤的浓度、鸟嘌呤的浓度和腺嘌呤的浓度，最后通过裂解液B的体积分别计算出待检测细胞中鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤的含量。