维管特异启动子控制抗菌蛋白基因的植物表达载体及培育抗黄萎病棉花的方法

摘要

本发明提供了一种维管启动子控制两种抗菌蛋白基因的植物表达载体以及一种培育抗黄萎病棉花的方法。该方法是通过将维管组织特异启动子AAP2控制下的益母草抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2整合到棉花基因组，实现了抗菌蛋白基因在转基因棉花根部维管组织中高量表达，在植株其它部位维管组织中适量表达，显著提高了棉花对黄萎病的抗性。应用这一方法获得的转基因棉花纯合T₂代植株温室病池接种落叶型和非落叶型黄萎病菌后，与非转基因对照相比，病情指数可分别降低40％和80％。

主权项

一种维管特异启动子控制抗菌蛋白基因的植物表达载体，其特征在于，为含有维管特异启动子AAP2控制抗菌蛋白基因LjAMP1的植物表达载体，所述载体p5‑AAP2‑LjAMP1，其构建步骤如下：以来自拟南芥AAP2基因的启动子取代植物表达载体p5‑LjAMP2上的组成型启动子CaMV35S，构建一个新的植物表达体，命名为p5‑AAP2‑LjAMP2；其中，启动子AAP2由序列1和序列2扩增得到，所述启动子AAP2如序列11所示；LjAMP1为基因序列12所示的核酸序列；P5植物表达载体为改选常用的pBI121载体而得；pBI121右边界附近有一个选择标记基因NPTII，以及Nos启动子和终止子；左边界附近为CaMV35S启动子控制下的GUS报告基因；改造过程分为下列几步：（1）首先利用EcoRⅠ酶进行单酶切，将pBI121载体切开；（2）将切口削平，再利用DNA连接酶进行连接，以去除pBI121载体上原有的EcoRI酶切位点，这一步之后的载体命名为pBI121‑R；（3）利用HindⅢ进行单酶切，将去掉EcoRⅠ酶切位点的pBI121‑R载体再次切开；（4）在切口处添加两端为HindⅢ‑EcoRⅠ酶切位点的接头，同时引入SalI和KpnI酶切位点，然后利用DNA连接酶进行连接，最终获得p5植物表达载体。