一种基于流式细胞术快速测定富营养化湖泊异养细菌的方法

摘要

本发明的目的是建立一种快速测定浅水湖泊中总异养细菌的方法，是一种基于流式细胞术的细菌计数方法。首先将样品固定、超声、过滤、SYBRGreenⅠ染色，然后通过流式细胞仪来检测异养细菌，采集前向和侧向散射光、SYBRGreenⅠ绿色荧光信号、自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号，其中用SYBRGreenⅠ绿色荧光信号来设置域值。利用前向与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响，而依据SYBRGreenⅠ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开，最后根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得异养细菌的准确数量。该方法省时省力，可开展大规模生态学调查，并且增加了细菌计数的精确度及准确性。

主权项

一种基于流式细胞术快速测定富营养化湖泊异养细菌的方法，其特征在于包括以下步骤：(1) 样品固定：在待测样品中加入终浓度为0.5‑1.5%，优选1%的固定剂，避光2‑4小时； (2) 样品前处理：吸取至少500ul样品，用无菌水1:8‑1:12，优选1:10稀释后进行超声波处理后经300目筛绢过滤； (3) 样品染色：吸取1ml样品，利用特异性核酸染料SYBR GreenⅠ对样品进行染色； (4) 样品的流式细胞分析：将样品管放置于流式细胞仪的样品台上，利用流式细胞仪对样品进行测试，采集前向散射光、侧向散射光、FL1通道的核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号、FL3通道的自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号数据；其中以核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号设置域值，利用绿色荧光信号将浅水湖泊中的浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来，同时根据FL3通道采集的自养浮游生物的叶绿素a的红色荧光信号，将细菌与浮游藻类区分开来； (5) 数据分析：通过流式细胞仪分析软件分析采集到的数据，利用前向散射光与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响；依据核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得样品中异养细菌的准确数量。