微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备及应用

摘要

本发明涉及一种微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备及应用。技术方案是：制备高质量抗体，将高效制备液相色谱纯化的溴乙酰氯克伦特罗与巯基化的血蓝蛋白合成免疫原免疫动物，得到抗血清；将纯化的溴乙酰氯克伦特罗与巯基化的琼脂糖反应得到克伦特罗-琼脂糖填料，装载成抗原亲和层析柱；用抗原亲和层析柱提纯抗血清中的克伦特罗特异性抗体。克伦特罗免疫亲和层析柱的制备：将高质量抗体高密度偶联到过碘酸氧化的琼脂糖上制成抗体亲和填料，取25μl填料装入特制的小柱中制成微型免疫亲和层析柱。本发明所提供的免疫亲和层析柱可高效率、特异性富集待检样品中克伦特罗，与分析仪器、胶体金试纸条联用能提高检测的准确性、可靠性和敏感度。

主权项

一种微型克伦特罗免疫亲和层析柱制备的方法，其特征是：克伦特罗免疫亲和层析填料是由固相载体琼脂糖Agarose和与其偶联的经免疫亲和提纯的克伦特罗多克隆抗体组成；所述的经免疫亲和提纯的克伦特罗多克隆抗体是以将克伦特罗衍生为半抗原再与载体蛋白偶联为免疫原免疫动物取得抗血清，将抗血清经偶联有克伦特罗半抗原的免疫亲和柱纯化得到的；(1)活化的溴乙酰克伦特罗制备技术：采用溴乙酰氯与克伦特罗反应，生成溴乙酰克伦特罗，并使用制备型高效液相色谱仪HPLC分离纯化溴乙酰克伦特罗；(2)克伦特罗免疫原、包被配对抗原制备技术：采用二硫苏糖醇DTT还原已用十二烷基磺酸钠变性了的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白，即KLH或BSA，通过G25Sephadex脱盐制备巯基化蛋白；将所述经HPLC分离纯化的溴乙酰克伦特罗与巯基化的KLH或BSA合成免疫原免疫动物，制备抗血清；(3)制备巯基化Agarose：用过碘酸钠氧化Agarose，再与赖氨酸反应后用硼氢化钠还原，制备氨基化Agarose；用N‑羟基琥珀酰亚胺‑碘乙酸活化酯和氨基化Agarose反应生成碘乙酰化Agarose，然后与过量的DTT反应制备巯基化Agarose；(4)偶联溴乙酰克伦特罗的亲和柱的制备：将经HPLC分离纯化的溴乙酰克伦特罗与巯基化Agarose反应，形成溴乙酰克伦特罗‑Agarose的化学共价键复合体填料并用于制备偶联溴乙酰克伦特罗的亲和柱；(5)克伦特罗特异性抗体的分离纯化：采用偶联溴乙酰克伦特罗填料并装配抗原免疫亲和柱，把溴乙酰克伦特罗‑KLH/BSA免疫动物所得的抗血清中的克伦特罗特异性抗体分离并纯化，得到高特异性、高亲和力的克伦特罗多克隆抗体；(6)将所得的高特异性、高亲和力的克伦特罗多克隆抗体高密度偶联于用过碘酸钠氧化的Agarose上，得到高效克伦特罗免疫亲和层析填料；(7)将所述高效克伦特罗免疫亲和层析填料装载入微型柱中，制成微型高效免疫亲和层析柱。