双表达的AAV重组病毒的制备方法

摘要

本发明公开了一种双表达的AAV重组病毒的制备方法，采用基因克隆技术将合成的特异性PRRSV RNA干扰寡核苷酸序列克隆至AAV Helper Free System中的表达质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP的U6启动子下游，将PRRSV的ORF5-6结构蛋白基因克隆至pAAV-U6-IRES-hrGFP的CMV启动子的下游，构建成双效腺相关病毒载体pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA-ORF5-6，通过酶切及PCR鉴定后进行DNA测序以鉴定重组质粒。实验证实，双效质粒转染靶细胞Marc145，有延迟细胞病变的作用，说明双表达AAV疫苗载体能够转录出siRNA，对病毒的转录复制有一定的抑制效果。

主权项

一种双表达的AAV重组病毒的制备方法，其特征在于，采用基因克隆技术将合成的特异性PRRSV RNA干扰寡核苷酸序列克隆至AAV Helper Free System中的表达质粒pAAV‑U6‑IRES‑hrGFP的U6启动子下游，将PRRSV的ORF5‑6结构蛋白基因克隆至pAAV‑U6‑IRES‑hrGFP的CMV启动子的下游，构建成双效腺相关病毒载体pAAV‑U6‑IRES‑hrGFP‑siRNA‑ORF5‑6，通过酶切及PCR鉴定后进行DNA测序以鉴定重组质粒；具体包括以下步骤：1)pAAV‑U6‑IRES‑hrGFP‑siRNA质粒表达载体的制备：PRRSV‑shRNA引物序列的设计及合成：针对PRRSV JXA1毒株的基因组序列，设计筛选并合成DNA模板引物：SH‑A：5’‑GATGACGTCAGGCATCACTTTCAAGACGAGTGATGCCTGACGTCATCTTTTTTT‑3’SH‑B：：5’‑AAAAAAGATGACGTCAGGCATCACTCGTCTTGAAAGTGATGCCTGACGTCATC A‑3’：设立阴性对照，目的序列为已知序列碱基序列打乱后重排所得，酶切位点和发卡环结构相同；合成的单链目的基因片段的退火连接后形成双链DNA，与经Xba I和Age I双酶切的载体pAAV‑U6‑IRES‑hrGFP连接后转化，提取质粒进行PCR鉴定，并经DNA测序法鉴定，得到干扰性质粒pAAV‑U6‑IRES‑hrGFP‑shRNA；2)双表达质粒pAAV‑U6‑IRES‑hrGFP‑shRNA‑ORF5‑6的构建：PRRSV免疫蛋白组合基因ORF5‑6的获得：针对PRRSV设计ORF5及ORF6全基因设计其引物，引物序列分别为：F51：5’‑ataGGATCCACCATGTTGGGGAAGTGCTTG‑3’(BamH I)F52：5’‑GCGAATTC AAGAAGGTCAAAATTCAACAG ctagagacgaccccatag‑3'(EcoR I)F61：5’‑ATAGAATTC atggggtcgtctctagacga‑3’(EcoR I)F62：5’‑AGC ctcgag ttatttggcatatttaacaagg‑3’(Xho I)利用Qigen RNA提取试剂盒提取PRRSV JXA1毒株RNA，利用RT‑PCR法获取ORF5及ORF6基因后连接到pMD18‑T载体上进行进行DNA测序分析；利用内切酶分别从T载体上双酶切下ORF5和ORF6，与经双酶切的pAAV‑U6‑IRES‑hrGFP‑shRNA连接，转化感受态细胞后挑斑，小量提取质粒后经PCR及酶切鉴定正确后测序表明，成功构建了PRRSV shRNA及ORF5‑6基因腺相关共表达载体pAAV‑U6‑IRES‑hrGFP‑shRNA‑ORF5‑6。