分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法

摘要

本发明提供了一种分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，稳定培养的新生鼠皮层神经细胞具有正常的T型钙离子通道的功能，适用于膜片钳技术对其生理特性及药理特性的研究，本实验操作易于掌握，是一种简单有效的稳定培养分离新生鼠皮层神经细胞的方法。本发明中通过稳定培养分离的新生鼠皮层神经细胞，从而显著提高了实验的成功率，稳定性和可重复性。

主权项

一种分离培养新生鼠皮层神经细胞记录T型钙通道电流的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、将出生24h处死后的大鼠的全脑取出，用解剖液清洗数次；Ｂ、置于冰浴中解剖，小心分离得到皮层，仔细剔除皮层上的微细血管后，充分剪碎皮层组织；Ｃ、将剪碎的皮层组织置于广口瓶内，加入同体积的0.25%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，置于5%二氧化碳、37℃培养箱内消化18‑25分钟；Ｄ、充分消化后，加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻吹打数分钟至液体成迷糊状即停止吹打，用70微米网筛过滤，收集细胞悬液；Ｅ、将细胞悬液以1000rpm离心5分钟，弃上清，根据计数结果，调整细胞密度，接种于放置了多聚赖氨酸包被处理的盖玻片培养皿，用添加了B27的Neurobasal培养液，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养7‑21天，得到生长有皮层神经细胞的盖玻片；F、将生长有皮层神经细胞的盖玻片加入灌流槽中，置于倒置显微镜载物台上，用细胞外灌流液灌流清洗细胞，流速保持1‑1.5毫升/分钟；选择生长饱满的细胞进行膜片钳实验，采用标准的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳模式下记录T型钙通道电流；实验在22‑25℃下进行，使用的玻璃电极充满细胞内灌流液，电阻为3‑5兆欧；步骤Ａ中所述的解剖液由500毫升HBSS、5毫升青霉素或链霉素、5毫升浓度为1M的氯化镁、3.5毫升浓度为1M的HEPES和5毫升浓度为200mM的L‑glutamine配制而成，经过滤且高压灭菌后4℃冷藏备用；步骤Ｆ中所述的细胞内灌流液由CsCl、四乙基氯化铵、CaCl₂、镁‑三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH调节pH至7.2，配制成的溶液中，CsCl的浓度为120mM，四乙基氯化铵的浓度为20mM，CaCl₂的浓度为1mM，镁‑三磷酸腺苷的浓度为5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为11mM，4‑羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为10mM；溶液的渗透压为310mOSm。