凝集素富集和¹⁸O标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法

摘要

本发明提供了一种糖蛋白组定量方法，具体步骤为：将来自不同疾病或者相同疾病不同阶段患者的血清样本分为两组，除去高丰度蛋白，测定蛋白浓度，取等蛋白量样本进行除盐和酶解；将所得的酶解产物进行凝集素亲和层析以得到相应的亚糖蛋白组，冻干；分别以H₂¹⁸O和H₂¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合固化胰酶进行C端标记，冻干后，再以H₂¹⁸O和H₂¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合N-糖酰胺酶进行N糖基化位点标记，冻干；将两组样本混合上样进行液相色谱-质谱检测，建立基于Mascot Distiller的自定义算法进行定量数据处理。本发明拥有足够的精确性和可重复性，在1∶10～10∶1的范围之内能够保持线性，可精确的反应样本中不同N-糖链结构糖型的糖蛋白变化。

主权项

一种糖蛋白组定量方法，其特征在于，具体步骤为：第一步：将来自不同疾病或者相同疾病不同阶段患者的血清样本分为两组，除去高丰度蛋白，测定蛋白浓度，取等蛋白量样本进行除盐和酶解；第二步：将第一步所得的酶解产物进行凝集素亲和层析以得到相应的亚糖蛋白组，冻干；第三步：分别以H₂¹⁸O和H₂¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合固化胰酶进行C端标记，冻干后,再分别以H₂¹⁸O和H₂¹⁶O制备的溶液重溶两组样本，联合N‑糖酰胺酶进行N糖基化位点标记，冻干；第四步：将两组样本混合上样进行液相色谱‑质谱检测，建立基于Mascot Distiller的自定义定量算法进行定量数据处理；所述的自定义定量算法采用的定量协议为前导扫描,所述的自定义定量算法中定义了三个独有修饰组来进行计算，A组定义为2个¹⁸O标记在C端及1个¹⁸O标记在N糖基化位点，B组定义为1个¹⁸O标记在C端及1个¹⁸O标记在N糖基化位点，C组定义为¹⁶O标记在上述位点，相对的丰度比值由以下公式计算得到：    ratio(¹⁸O/¹⁶O)= (Group A + Group B)/Group C；其中，ratio(¹⁸O/¹⁶O)代表¹⁸O标记的糖肽与¹⁶O标记糖肽的丰度比值，GroupA、Group B 和Group C分别代表A组、B组和C组的丰度。