一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗及其应用

摘要

本发明公开了一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗及其应用。本发明是通过引物扩增出高致病性猪蓝耳病病毒XH株的GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在两个基因中间插入FMDV-2A的序列，从而得到G-2A-M片段，最后通过SpeI和SalI两个酶切位点克隆到JpJEV-REP；另外，为了使M蛋白能够产生真实的N末端，G-2A-M片段的下游插入了IRES序列（G-2A-M-IRES），最后利用SalI-HF和SpeI两个酶切位点插入到pJEV-REP中，最终构建基于JEV复制子并且能够表达GP5和M蛋白的高致病性蓝耳病疫苗。

主权项

一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗，其特征在于将蓝耳病的结构基因GP5与M蛋白插入到基于DNA水平的JEV复制子pJEV‑REP，所述JEV复制子包括CMV启动子、5’UTR、C蛋白N端的前23个氨基酸C23、E蛋白C端的NS1蛋白的信号肽、所有非结构蛋白编码区、3’UTR、核酶、polyA序列、GP5蛋白编码区、FMDV‑2A的序列和M蛋白编码区；所述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗的构建方法包括如下步骤：设计引物，其序列如SEQ ID NO:19~28所示，扩增出高致病性猪蓝耳病病毒XH株的GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在两个基因中间插入FMDV‑2A的序列，从而得到G‑2A‑M片段，最后通过SpeI和SalI两个酶切位点克隆到JpJEV‑REP；另外，为了使M蛋白能够产生真实的N末端，G‑2A‑M片段的下游插入了IRES序列G‑2A‑M‑IRES，最后利用SalI‑HF和SpeI两个酶切位点插入到pJEV‑REP中，最终构建基于JEV复制子并且能够表达GP5和M蛋白的高致病性蓝耳病疫苗；所述的IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；所述的G‑2A‑M片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；所述FMDV‑2A的序列是以HP PRRS基因RNA的反转录产物为模板，引物MF‑FMDVF2A‑F 与MR‑ SalI扩增出2A序列的后45个碱基及M基因的完整编码区。