苯妥因检测方法

摘要

本发明公开了两种苯妥因的检测方法，包括以下步骤：将待测样本与抗苯妥因特异性抗体接触；根据待测样本中的物质与抗体的结合情况，判断样本中苯妥因的含量，其中抗苯妥因特异性抗体由苯妥因免疫原免疫动物得到。本发明的两种检测方法，特异性高，可以准确地测定苯妥因的含量，为苯妥因的临床药物浓度实时监测提供了依据。

主权项

一种苯妥因(5，5‑Diphenyl‑2，4‑imidazolidinedione)的均相酶免疫检测方法，使用苯妥因的均相酶免疫检验试剂，包括以下操作步骤：(1)采用全自动生化分析仪，将待测样本与苯妥因检测试剂分别放入样本仓和试剂仓；(2)按照下表进行检测项目参数设置；(3)测定OD340nm的吸光值；(4)制作标准曲线来定量样本中的苯妥因浓度；所述的检测试剂由R1试剂和R2试剂组成，其制备方法如下：R1试剂的制备：将抗苯妥因特异性抗体稀释到R1缓冲液中，均相R1缓冲液含50mMTris，0.25％BSA，50mM葡萄糖‑6‑磷酸(Glucose‑6‑phosphate，G‑6‑P)和50mM烟碱腺嘌呤二核苷酸，抗苯妥因特异性抗体与R1缓冲液的体积比为1∶1000‑1∶4000；R2试剂的制备：a.酶标偶联物的制备：酶为β‑半乳糖苷酶或葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶，将酶磷酸盐缓冲液与活化的结构式(III)的苯妥因衍生物通过三丁胺法进行交联得到酶‑苯妥因偶联物，b.将制备好的酶‑苯妥因偶联物稀释到R2缓冲液中，R2缓冲液含有100mMTris，0.25％BSA；抗苯妥因特异性抗体与R2缓冲液的体积比为1∶1000‑1∶4000；所述抗苯妥因特异性抗体由苯妥因免疫原免疫动物后生产得到，所述的苯妥因免疫原，其结构式如式(I)所示：式中，R为‑O‑(CH₂)₄‑COO‑，载体为牛血清蛋白(BSA)；苯妥因免疫原合成方法如下：A.苯妥因衍生物的合成：其化学结构如式(III)所示，(一)合成化合物31)准确称取5.3g的羟基二苯酮(化合物1)和1.9g无水碳酸钾，将这两个化合物加入长颈瓶中；2)加入150mL DMF，超声15min溶解化合物，3)加入6.5g5‑溴戊酸乙酯(化合物2)，在55℃下搅拌72h，4)将溶液降至室温后过滤，用5mL DMF溶解反应物，真空干燥，5)用150mL浓碳酸氢钠溶液溶解残留物，经150mL EtOAc萃取，得到的有机相加入硫酸钠进行干燥，6)粗提化合物用硅胶键合柱进行快速层析纯化，最后得到白色固体化合物3；(二)合成化合物41)称取5.0g化合物3至100ml甲醇中，加入80mL2MNaOH溶液，液体逐渐由澄清的无色溶液变为白色沉淀，2)继续加入2M NaOH溶液至溶液重新变为澄清的无色溶液，室温快速搅拌过夜，3)将该混合溶液浓缩，加150mL水溶解白色固体，用80mL甲基叔丁基醚洗涤两次，4)将该混合溶液浓缩并用4M盐酸酸化至水层pH值为2‑3，用100mL EtOAc萃取两次，5)得到的有机相加入硫酸钠进行干燥，获得油状粗提化合物，6)用硅胶键合柱进行快速层析纯化粗提化合物，最后得到白色固体化合物4，(三)苯妥因衍生物的合成：1)把下列材料加入到一个不锈钢的压热器中：3.0g化合物4，0.8gKCN，6.0g(NH₄)₂CO₃，5mL水，35mLDMF，2)加热至120℃并保温120h，3)降温至室温，用100mL2.5M NaOH溶解混合体，用80mL乙醚洗涤两次，4)将该混合溶液用6N盐酸酸化至水层pH值为4‑5，用100mL EtOAc萃取两次，5)用盐水洗涤有机合成物，干燥，浓缩后获得油状粗提化合物，6)用硅胶键合柱进行快速层析纯化粗提化合物，最后得到白色固体的苯妥因衍生物；B.苯妥因免疫原的合成，其结构式如式(I)所示，具体的合成方法如下：1)将200mg BSA溶解于50ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的苯妥因衍生物、3.5ml DMF、3.5ml乙醇、7.0ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、200mg1‑乙基‑3‑(‑3‑二甲氨丙基)碳二亚胺(EDAC)、50mg N‑羟基琥珀酰亚胺(N‑hydroxysuccinimide，Sulfo‑NHS)，将这些化学品在室温下搅拌溶解，反应30min；3)将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到苯妥因免疫原。