一种藻类叶绿体DNA的提取方法

摘要

本发明涉及一种藻类叶绿体DNA的提取方法，新鲜或冷冻藻体为原料，用组织匀浆机匀浆，加入缓冲液A以3,000-6,000×g离心力离心处理，取沉淀物，加入缓冲液B，在60-70℃下水浴裂解1-2h，裂解液去除变性蛋白质，加入CsCl和Hoechst 33258，以360,000-400,000×g离心力离心8-12h，取出含叶绿体DNA条带去除Hoechst 33258，加入2.5～3.5M醋酸钠、双蒸水和异丙醇，在-20℃下放置20～40min，离心力12,000-16,000×g离心15-30min，得到的沉淀纯化后，即得到藻类叶绿体DNA。与现有技术相比，本发明简化了提取步骤，操作简单易行，提高了藻类叶绿体DNA的提取率和纯度，提取的藻类叶绿体DNA得率在150-200μg/g(新鲜藻体)，且完全能够满足基因组测序、特异性酶切、RAPD、PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要。

主权项

一种藻类叶绿体DNA的提取方法，其特征包括以下步骤：1)选取新鲜或冷冻的裙带菜或孔石莼，洗净沥水后，称取20‑60g藻体，加150‑300ml缓冲液A，用组织匀浆机在0‑4℃下，匀浆成藻液；2)将匀浆后的藻液用60目尼龙布过滤，将滤液离心处理后，弃上清液，取沉淀物；3)在沉淀物中加入10‑30ml缓冲液B，在60‑70℃下水浴裂解1‑2h，得到裂解液；4)将裂解液用体积比24～26∶23～25∶1的酚‑氯仿‑异戊醇和体积比23～25∶1的氯仿‑异戊醇处理去除变性蛋白质，再加入CsCl和Hoechst33258，以360,000‑400,000×g离心力离心8‑12h，其中CsCl与Hoechst33258的加入量为终浓度1.35‑1.65g／ml和10‑30μg／ml；5)迅速取出含叶绿体DNA的条带，用0.8‑1.2M NaCl饱和异丙醇去除Hoechst33258；6)在去除Hoechst33258的叶绿体DNA溶液中加入浓度2.5‑3.5M的醋酸钠、双蒸水和异丙醇，体积比为2∶2∶4∶5，混合均匀后混合液在‑20℃下，放置20‑40min；7)将混合液以12,000‑16,000×g离心力离心15‑30min，得到的沉淀经过65‑75％乙醇洗涤去杂后，即得纯的藻类叶绿体DNA；其中，所述的缓冲液A的组分及配比如下：调节pH至7.5，补充水至1L；所述的缓冲液B的组分及配比如下：调节pH至7.5，补充水至1L。