一种区分坦布苏病毒活毒与灭活疫苗产生抗体的检测方法

摘要

本发明提供了一种区别坦布苏病毒活毒与灭活疫苗产生抗体的ELISA检测方法；分离纯化利用大肠杆菌原核表达的坦布苏病毒E蛋白和NS5蛋白；在96孔ELISA板中加入封闭液、待检鸭血清、PBST稀释液、PBST稀释液稀释HRP标记的兔(或羊)抗鸭的二抗等，终止反应后读取OD450nm值，结果中E蛋白OD450nm为阳性且NS5蛋白OD450nm值为阴性说明抗体为灭活疫苗产生；如果两者均为阳性说明抗体由活毒感染产生。本发明建立的坦布苏病毒ELISA检测方法能够区分坦布苏病毒活毒与灭活疫苗产生抗体，对鸭坦布苏病毒抗体水平监测和坦布苏病毒感染鉴定具有重要的作用，同时本发明操作简单，成本较低，适用于大规模的样品检测。

主权项

一种区分坦布苏病毒活毒与灭活疫苗产生抗体的检测方法，其特征在于通过以下步骤实现：1）分离纯化利用大肠杆菌原核表达的坦布苏病毒E蛋白和NS5蛋白；用pH为9.5‑9.7的1×碳酸盐缓冲液分别稀释E蛋白和NS5蛋白，使E蛋白浓度为0.5ng/μL，NS5蛋白浓度为1.0ng/μL；将稀释的E蛋白溶液和NS5蛋白溶液均按100μL/孔分别加入到两个96孔ELISA板中，4℃孵育12小时，用PBS洗涤液洗5次，甩干板上残余液体；2）将步骤1）甩干后的两个96孔ELISA板中每孔加入200μL封闭液，室温孵育1h，用PBS洗涤液洗5次，甩干板上残余液体；3）将步骤2）甩干后的两个96孔ELISA板中每孔先加入10μL待检鸭血清再加入90μLPBST稀释液，混匀，37℃孵育1h，用PBS洗涤液洗5次，甩干板上残余液体；4）用PBST稀释液稀释HRP标记的兔或羊抗鸭的二抗，将稀释的二抗加入步骤3）甩干后的两个96孔ELISA板中，每孔100μL，37℃孵育1h，用PBS洗涤液洗5次，甩干板上残余液体；5）将TMB显色液按100μL/孔加入到步骤4）甩干后的两个96孔ELISA板中，37℃避光孵育15min；6）每孔加入50μL3M硫酸终止液，轻轻振荡，用酶标仪读取OD450nm值：样品中E蛋白OD450nm值判定结果：OD450≥0.6897，待检血清为阳性；OD450<0.5841，待检血清为阴性；0.6897＞OD450≥0.5841，判为可疑，按照步骤1）‑6）重新检测；样品中NS5蛋白OD450nm值判定结果：OD450≥0.5017，待检血清为阳性；OD450<0.4223，待检血清为阴性；0.5017＞OD450≥0.4223，判为可疑，按照步骤1）‑6）重新检测；结果中E蛋白OD450nm为阳性且NS5蛋白OD450nm值为阴性说明抗体为灭活疫苗产生；如果两者均为阳性说明抗体由活毒感染产生。