一种分析微藻代谢组的方法

摘要

本发明公开了一种分析微藻代谢组的方法，该方法包括：微藻细胞收集及淬灭；提取细胞内代谢物；代谢物衍生化；最后通过GC-MS对样品分析得到代谢组结果。本发明提供了一种分析微藻代谢组的手段，这种手段涉及代谢反应的终止、代谢物的提取、代谢物的分析，从而获得微藻在不同培养条件下的代谢物的定性和定量结果，为微藻代谢组的分析提供了方法，这种方法对促进微藻的代谢研究具有重要的意义。

主权项

一种分析微藻代谢组的方法，其特征是包括如下步骤：(1)微藻细胞收集及淬灭：取出已培养好的微藻藻液样品3‑5份，每份100‑150mL，4℃下3000‑5000rpm，离心3‑4min，收集下层的细胞，用3‑5mL代谢终止液在‑40℃下淬灭5‑10分钟，终止代谢反应，在‑80℃下冷冻干燥4‑6h获得冻干细胞；所述代谢终止液为含有1500mg·L^‑1NaNO₃，36mg·L^‑1CaCl₂·2H₂O，75mg·L^‑1MgSO₄·7H₂O和40mg·L^‑1K₂HPO₄·3H₂O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1:2；（2）提取细胞内代谢物：从步骤（1）获得的3‑5份冻干细胞中各取15‑25mg分别置于离心管中，每管加入‑40℃的代谢提取液1‑2mL，混匀，盖紧并放入液氮中，反复冻融3‑5次，在‑20℃下4000‑6000rpm离心1‑2min，收集上清，另向残渣中加入0.5‑1mL代谢提取液，‑20℃下4000‑6000rpm离心1‑2min，离心后，将两次上清液合并，加入10‑20μg氘标记琥珀酸，得混合液，各取200μL混合液，在‑80℃下冷冻干燥2‑4小时；所述代谢提取液为体积百分含量为50%的甲醇水溶液；（3）代谢物衍生化向步骤（2）获得的样品中各加入20mg·mL^‑1的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液50μL，于40℃水浴中反应60‑80min，反应结束后加入80μL N‑甲基‑N‑三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴再反应60‑80min，8000‑12000rpm离心1min，取上清100μL放入已编号的GC进样瓶，室温放置2h；（4）GC‑MS检测采用GC‑MS对步骤（3）获得的3‑5份样品进行定性和定量处理，得到微藻代谢组分析结果；所述步骤（4）的检测条件如下：色谱柱：DB‑5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；进样量：1μL；分流比：10:1；进样口温度：280℃；GC interface温度：270℃；氦气流速：恒压，91KPa；升温程序：70℃保持2min，以5℃·min^‑1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；电离电压：70eV；源温：250℃；扫描范围：50‑800m/z；扫描速度：2scan·s^‑1。